2026年8月5日，河北医科大学、络病理论创新转化全国重点实验室、河北络学创新医药研究院等单位贾振华、齐晖、侯云龙团队，联合厦门大学、上海以岭药业及河北以岭医院等单位，在Phytomedicine （中科院1区，IF=11.3，TOP期刊）在线发表题为“Tongxinluo attenuates pulmonary microvascular endothelial cell senescence in COPD by targeting the GADD45B-MAPK axis”的研究论文。熊明宇为第一作者，侯云龙、齐晖和贾振华为通讯作者。该论文于2026年1月27日投稿，7月14日修回，8月3日接收，8月5日在线发表。
本研究围绕慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的“肺微血管内皮细胞衰老”展开。研究团队利用香烟烟雾（CS）诱导的C57BL/6J小鼠和ERCC1±加速衰老小鼠模型，结合香烟烟雾提取物（CSE）诱导的人肺微血管内皮细胞（HPMECs）模型，发现肺微血管内皮细胞（PMEC）衰老会随COPD进展逐渐加重，并与肺结构破坏和肺功能下降密切相关。进一步研究表明，通心络（TXL）能够抑制这一衰老过程。通过Bulk RNA-seq、LC-MS/MS、网络药理学、分子对接、生物层干涉（BLI）及细胞功能实验，研究进一步锁定GADD45B-MAPK信号轴，并筛选出人参皂苷Rg1作为潜在关键活性成分。
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【摘 要】
背景：越来越多的证据表明，肺组织细胞加速衰老是慢性阻塞性肺疾病（COPD）发生发展的重要促进因素。然而，衰老的肺微血管内皮细胞（PMECs）在COPD中的具体作用，以及针对这类细胞的治疗策略，目前仍缺乏充分研究。通心络（Tongxinluo，TXL）是一种具有“益气活血通络”作用的中药复方制剂，在COPD中表现出一定的干预潜力，其作用可能与减轻PMEC损伤有关，但其具体分子机制和关键活性成分尚未完全阐明。
目的：探讨PMEC衰老在COPD发病进程中的作用，并阐明TXL是否以及如何通过调节PMEC衰老减缓COPD进展。
方法：采用香烟烟雾（cigarette smoke，CS）暴露分别在C57BL/6J小鼠和ERCC1±小鼠中建立COPD模型，并给予TXL干预。通过RT-qPCR、免疫荧光染色、H&E染色和肺功能检测，动态评估细胞衰老及COPD进展。体外采用香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）刺激人肺微血管内皮细胞（HPMECs）建立细胞损伤模型。进一步整合Bulk RNA-seq、LC-MS/MS、网络药理学及体外细胞实验，筛选TXL减轻PMEC衰老并延缓COPD进展的关键靶点和生物活性成分。
结果：在C57BL/6J和ERCC1± COPD小鼠中，CS暴露均诱导PMEC衰老，表现为P21、P16、P53和γ-H2AX等衰老标志物，以及IL-6、IL-1β和TNF-α等衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）升高，并与肺泡结构破坏和肺功能下降相关。ERCC1±小鼠表现出更加严重的细胞衰老和COPD进展，进一步提示DNA损伤在衰老相关病理过程中的重要作用。TXL能够减轻上述改变，降低衰老标志物水平、改善肺组织形态并恢复肺功能。
体外实验进一步显示，TXL及其活性成分能够有效逆转CSE诱导的HPMEC衰老。通过整合RNA测序、TXL全成分LC-MS/MS分析、网络药理学及验证实验，研究发现TXL及其潜在活性成分人参皂苷Rg1可通过调控GADD45B-MAPK信号通路减轻CSE诱导的PMEC衰老。
结论：PMEC衰老随时间持续加重，是推动COPD进展的重要因素。TXL及其潜在活性成分人参皂苷Rg1可通过调控PMEC中的GADD45B-MAPK信号级联，显著抑制COPD相关病理进展。本研究为理解COPD发生机制提供了新的视角，也提示TXL及人参皂苷Rg1具有通过调节细胞衰老干预COPD的研究价值。
结合动物、细胞、转录组及药理学实验，作者提出：持续CS/CSE刺激可诱导PMEC中GADD45B和FOS升高，并激活MAPK相关信号，促进炎症因子产生及细胞衰老，最终加速COPD相关肺组织结构和功能损伤；TXL则可抑制该信号过程，其中人参皂苷Rg1被鉴定为能够与GADD45B直接结合的潜在关键活性成分，从而参与PMEC衰老调控。
01
研究背景及科学问题
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见的慢性呼吸系统疾病，以进行性、不可逆性气流受限为主要特征。患者通常表现为活动后呼吸困难、慢性咳嗽和痰液分泌增多等持续性呼吸系统症状，严重影响生活质量，并造成较高的全球疾病负担。COPD的发生发展主要涉及气道和肺泡异常炎症反应。
长期香烟烟雾（CS）和环境污染物暴露一直被认为是COPD的重要危险因素。近年来研究逐渐认识到，以细胞衰老为突出特征的肺组织加速老化，可能是这些危险因素推动COPD进展的重要中间环节。COPD肺组织中已经发现多种与细胞衰老相关的病理变化，包括线粒体功能障碍、端粒缩短、持续性低度炎症、蛋白质稳态紊乱、表观遗传改变以及DNA损伤修复障碍。
细胞衰老是细胞在DNA损伤、氧化应激、致癌基因激活等内源性或外源性刺激下进入的一种稳定且通常不可逆的细胞周期停滞状态。这一过程不仅导致细胞增殖停止，同时伴随显著的基因表达和分泌表型改变，例如P21、P16和β-半乳糖苷酶等衰老标志物升高，以及大量衰老相关分泌表型（SASP）分子的产生。SASP可进一步诱导慢性炎症、氧化应激和代谢紊乱等一系列病理过程。临床上，COPD患病率在老年人群中明显升高，而气流受限的逐渐进展也呈现出类似肺功能加速老化的特点。因此，抑制细胞衰老逐渐成为COPD干预的重要研究方向。
DNA损伤累积是衰老的核心特征之一，也是年龄相关功能下降和疾病发生的重要驱动因素。切除修复交叉互补组1（excision repair cross-complementation group 1，ERCC1）是核苷酸切除修复（NER）通路中维持基因组完整性的关键酶。因此，ERCC1功能缺陷动物被广泛用作加速衰老模型，用于研究衰老在疾病过程中的作用。
肺血管具有独特的生理结构，由高密度微血管网络构成，并能够在低压、低阻力条件下容纳心输出量。人肺单细胞RNA测序研究显示，肺微血管内皮细胞（PMECs）是肺组织中数量丰富的细胞群之一。PMEC与肺泡上皮细胞共同构成重要的气血屏障，通过黏附连接、紧密连接和缝隙连接等细胞间结构形成半透性连续单层，从而参与气体交换、血管张力以及血液与肺间质之间液体和溶质运输的调节。
越来越多证据提示，PMEC可能是COPD病理过程中的重要细胞靶点。年龄增长及环境应激可在COPD早期诱导PMEC提前进入复制性衰老，表现为端粒酶活性下降、端粒缩短、P21和P16升高以及SASP过度分泌。衰老PMEC的累积还可进一步加重炎症和氧化应激，形成恶性循环并推动COPD进展。然而，驱动PMEC衰老的具体分子机制目前仍未得到充分阐明，相应的干预策略也有待进一步探索。
传统中药因具有多成分、多靶点调节特点，在COPD等复杂疾病中的应用受到关注。通心络（TXL）是“孙络—微血管”保护理论的代表性复方制剂，对心脏、脑和肾脏等不同微血管床的内皮细胞均表现出多靶点保护作用。既往研究提示，TXL能够保护心肌梗死、脑梗死、糖尿病相关并发症等疾病中的微血管内皮屏障。前期研究还提示，TXL可能通过改善肺血管内皮功能、保护PMEC而减轻COPD模型中的病理进展。
不过，TXL在COPD中发挥作用的具体分子机制及其关键活性成分，特别是其是否通过干预PMEC衰老发挥作用，目前仍不清楚。因此，本研究同时采用CS诱导COPD小鼠模型和CSE刺激HPMEC模型，系统分析TXL对PMEC衰老的影响及其潜在分子机制，以进一步理解PMEC衰老与COPD进展之间的关系，并为TXL相关干预研究提供实验依据。
02
重要发现及亮点
香烟烟雾诱导细胞衰老，并与COPD进展形成恶性循环
为了明确COPD发生过程中细胞衰老的动态变化，研究首先建立CS诱导的小鼠COPD模型，并于暴露后4、12和24周采集样本。
RT-qPCR结果显示，IL-6、IL-1β和TNF-α三种关键SASP因子的转录水平从CS暴露第12周开始显著升高；值得注意的是，P16、P21和P53三种核心衰老标志物的mRNA水平在CS暴露4周时即已明显升高，提示细胞衰老可能在COPD病程早期已经启动。
随后，研究分别在C57BL/6J小鼠和ERCC1±加速衰老小鼠中诱导COPD。H&E染色显示，CS暴露4周时两种小鼠的肺泡结构均尚未出现明显变化；至12和24周，两种模型均表现出明显的肺泡扩张和肺泡数量减少。ERCC1±小鼠在12和24周时表现出更加严重的肺气肿样改变以及更明显的肺泡数量下降。
肺功能检测同样显示，CS暴露12和24周后，两种小鼠均出现明显功能异常，包括功能残气量（FRC）、弦顺应性（Cchord）及总肺容量（TLC）增加，呼气峰流速（PEF）降低；至24周时，FEV20/FVC明显下降。ERCC1±小鼠中，部分肺功能改变在4周时便已经出现，提示加速衰老背景可促进COPD病理进展。
图1：CS诱导COPD进展过程中C57BL/6J和ERCC1±小鼠肺组织形态及功能变化。（A）C57BL/6J和ERCC1±转基因小鼠在CS暴露4、12和24周后的代表性肺组织H&E染色图，比例尺=100 µm，n=4。（B–C）根据A中图像计算的平均线性截距（MLI，B）和平均肺泡数（MAN，C）。（D）COPD条件下C57BL/6J与ERCC1±小鼠MLI和MAN比较。（E–F）CS暴露不同时间点C57BL/6J小鼠（E）和ERCC1±小鼠（F）肺功能参数的动态变化，包括功能残气量（FRC）、弦顺应性（Cchord）、呼气峰流速（PEF）以及20 ms用力呼气容积与用力肺活量比值（FEV20/FVC）。（G）C57BL/6J与ERCC1±小鼠上述肺功能参数比较。P值采用双因素ANOVA并进行Newman–Keuls检验。*P<0.05，**P<0.01，表示差异具有统计学意义。
进一步通过免疫荧光检测P21发现，随着CS暴露时间延长，两种小鼠肺组织中的P21均逐渐升高。12和24周时，ERCC1±小鼠P21表达明显高于C57BL/6J小鼠，而4周时两组之间尚无显著差异。总体来看，长期CS暴露可逐步加重肺组织细胞衰老，而ERCC1±小鼠表现出更加明显的形态、功能损伤及加速衰老表型，支持衰老与COPD病理进展之间存在相互促进关系。
图2：细胞衰老与COPD进展之间的双向关系。（A–C）C57BL/6J小鼠和ERCC1±小鼠在CS暴露4、12和24周后肺组织P21的代表性免疫荧光染色（A）及定量结果，其中B为C57BL/6J小鼠，C为ERCC1±小鼠；比例尺=50 µm，n=5。（D）COPD条件下C57BL/6J与ERCC1±小鼠P21表达水平比较。P值采用双因素ANOVA并进行Newman–Keuls检验。**P<0.01，表示差异具有统计学意义。
PMEC衰老与COPD进展及肺功能下降密切相关
研究进一步聚焦PMEC。通过CD31与γ-H2AX、P16和P53的共免疫荧光染色发现，CS暴露4周时，C57BL/6J和ERCC1±小鼠的PMEC衰老已经明显增加，且ERCC1±小鼠这一改变更加突出。
Pearson相关分析显示，在两种小鼠中，PMEC衰老程度，即CD31+/γ-H2AX+、CD31+/P16+或CD31+/P53+细胞比例，均与FEV20/FVC呈显著负相关。结果表明，PMEC衰老水平越高，肺功能下降越明显，提示PMEC衰老可能是COPD病理进展的重要参与因素。
图3：肺微血管内皮细胞（PMEC）衰老与慢性阻塞性肺疾病（COPD）进展及肺功能下降相关。（A）C57BL/6J和ERCC1±小鼠在CS暴露4、12和24周后，肺组织中CD31分别与γ-H2AX、P53或P16共免疫荧光染色的代表性图像。比例尺=50 µm，n=5；蓝色：DAPI，绿色：CD31，红色：γ-H2AX、P53或P16。（B–C）C57BL/6J小鼠（B）和ERCC1±小鼠（C）中，CD31阳性PMEC同时表达γ-H2AX、P53或P16的比例定量。（D）COPD条件下C57BL/6J和ERCC1±小鼠PMEC中γ-H2AX、P53和P16水平比较。（E–F）CS暴露4、12和24周后，C57BL/6J小鼠（E）和ERCC1±小鼠（F）PMEC衰老与肺功能参数FEV20/FVC之间的Pearson相关分析。数据以均值±标准差（SD）表示。P值采用双因素ANOVA并进行Newman–Keuls检验。**P<0.01，表示差异具有统计学意义。
通心络通过抑制PMEC衰老减轻COPD相关肺结构和功能损伤
在C57BL/6J和ERCC1± COPD模型中给予TXL后，H&E染色显示，TXL可明显减轻CS暴露12和24周引起的肺结构损伤，包括肺泡扩张和肺泡数量减少。
肺功能检测显示，在两种小鼠中，TXL可在CS暴露12周后提高PEF；至24周时，可降低Cchord和FRC，并改善FEV20/FVC。
图4：TXL改善C57BL/6J和ERCC1±小鼠CS诱导的肺组织形态及功能变化。（A）C57BL/6J和ERCC1±转基因小鼠三组实验的代表性肺组织H&E染色图：对照组（室内空气暴露）、CS暴露组和CS暴露联合TXL治疗组。样本分别于CS暴露开始后4、12和24周采集。比例尺=100 µm，n=4。（B–C）根据A中图像计算MLI（B）和MAN（C）。（D–E）在指定时间点动态检测C57BL/6J小鼠（D）和ERCC1±小鼠（E）对照组、CS组和TXL组的FRC、Cchord、PEF、TLC及FEV20/FVC。数据以均值±SD表示。P值采用单因素ANOVA并进行Newman–Keuls检验。*P<0.05，**P<0.01，表示差异具有统计学意义。
RT-qPCR进一步显示，在C57BL/6J和ERCC1±小鼠中，TXL从CS暴露4周开始即可减轻IL-6、IL-1β、TNF-α等SASP以及P53的升高；至12周时，还可抑制P21和P16的升高。
支气管肺泡灌洗液（BALF）ELISA结果显示，IL-1β和TNF-α随CS暴露时间延长逐渐升高，而TXL可降低其水平。
图5：TXL减轻C57BL/6J和ERCC1± COPD小鼠肺组织中CS诱导的SASP及衰老标志物mRNA升高。（A–B）对照组、CS组和TXL组C57BL/6J小鼠（A）或ERCC1±小鼠（B）在不同时间点肺组织中的SASP因子IL-6、IL-1β、TNF-α及衰老标志物P16、P21、P53的相对mRNA表达水平，n=3。（C–D）采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测C57BL/6J和ERCC1±小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中的IL-1β和TNF-α，n=5。数据以均值±SD表示。统计学显著性采用单因素ANOVA并进行Newman–Keuls多重比较检验；P53和P21表达数据采用非参数Kruskal–Wallis检验。*P<0.05，**P<0.01，表示差异具有统计学意义。
CD31分别与γ-H2AX、P16和P53共免疫荧光进一步证明，TXL从CS暴露4周开始一直到24周均可抑制PMEC衰老，并且这一作用在C57BL/6J和ERCC1±小鼠中均可观察到。上述结果共同支持：TXL至少部分通过抑制PMEC衰老减轻COPD进展。
图6：TXL减轻CS诱导的肺微血管内皮细胞衰老。（A）C57BL/6J和ERCC1±小鼠对照组、CS组及TXL组在不同时间点肺组织中CD31分别与γ-H2AX、P53和P16共免疫荧光染色的代表性图像。比例尺=50 µm，n=5；蓝色：DAPI，绿色：CD31，红色：γ-H2AX、P53或P16。（B–D）CD31阳性PMEC同时表达γ-H2AX（B）、P53（C）和P16（D）的比例定量。数据以均值±SD表示。P值采用单因素ANOVA并进行Newman–Keuls检验。**P<0.01，表示差异具有统计学意义。
通心络减轻CSE诱导的HPMEC衰老
为进一步验证TXL对PMEC衰老的直接影响，研究采用CSE刺激HPMEC建立体外损伤模型。
SA-β-gal染色和γ-H2AX免疫荧光显示，CSE显著增加β-半乳糖苷酶活性及γ-H2AX表达，提示HPMEC发生明显细胞衰老；TXL处理则显著抑制两种指标升高。
RT-qPCR进一步发现，CSE导致LMNB1下降，同时使P21、P16以及TNF-α、IL-1β等SASP相关因子升高，而TXL能够明显逆转这些变化。
图7：TXL显著改善CSE诱导的HPMEC体外细胞衰老。（A–C）CSE诱导HPMEC后的β-半乳糖苷酶及γ-H2AX染色（A）和定量结果（B、C），比例尺=100 µm，n=5。（D–H）采用RT-qPCR检测CSE处理HPMEC中P16（D）、P21（E）、LMNB1（F）、TNF-α（G）和IL-1β（H）的mRNA水平，n=5。数据以均值±SD表示。统计学显著性采用单因素ANOVA并进行Newman–Keuls检验；IL-1β、LMNB1和P16数据采用Kruskal–Wallis检验并进行Dunn多重比较检验。*P<0.05，**P<0.01，表示差异具有统计学意义。
通心络通过调控GADD45B-MAPK信号轴减轻PMEC衰老
为了明确TXL抗衰老作用的分子基础，研究对Control、CSE和TXL组HPMEC进行Bulk RNA-seq。以FC≥2、Q<0.05为阈值，CSE组与Control组之间共鉴定出4,531个差异表达基因（DEGs），TXL组与CSE组之间则鉴定出4,656个DEGs。
进一步筛选发现，CSE诱导升高而被TXL下调的基因有455个，CSE诱导下降而被TXL重新上调的基因有1,169个。KEGG富集分析显示，这些被TXL逆转的DEGs主要富集于寿命调控及MAPK等信号通路。
GSEA结果显示，CSE显著激活MAPK通路（ES=0.39，P=0，FDR=0.02）；TXL处理后MAPK通路呈抑制趋势（ES=-0.28，P=0，FDR=0.28），但后者未达到统计学显著性。
随后通过Cytoscape和STRING构建蛋白质—蛋白质相互作用（PPI）网络，筛选得到包括FOS、GADD45B、NR4A1和FOSB在内的23个枢纽基因。其中，GADD45B是两种分析共同得到的核心靶点。RT-qPCR进一步验证，TXL显著逆转CSE诱导的GADD45B和FOS升高。
由于GADD45B不仅同时位于两种PPI分析的核心，而且CSE诱导的表达变化幅度约为30倍，明显高于FOS约8倍的变化，因此研究进一步聚焦GADD45B。siRNA敲低GADD45B可模拟TXL的抗衰老作用，使CSE诱导的β-半乳糖苷酶活性和γ-H2AX水平下降约50%。而在敲低GADD45B基础上进一步加入TXL，并未产生额外增强作用，支持GADD45B-MAPK轴可能是TXL发挥PMEC抗衰老作用的重要通路。
图8：TXL通过抑制GADD45B/FOS-MAPK轴减轻CSE诱导的HPMEC衰老。（A）CSE组与Control组以及TXL组与CSE组差异表达基因（DEGs）的火山图。（B）Venn图显示由CSE诱导改变、随后又被TXL处理逆转的共同DEGs。（C）对B中TXL逆转的DEGs进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。（D）MAPK信号通路的基因集富集分析（GSEA），分别比较CSE组与Control组以及TXL组与CSE组。（E）基于RNA测序（RNA-seq）数据绘制MAPK信号通路关键基因表达模式热图。（F–G）分别采用Cytoscape（F）和STRING（G）对TXL核心靶点进行蛋白质—蛋白质相互作用（PPI）网络分析，并突出显示核心节点。（H）RT-qPCR验证Control、CSE和TXL组HPMEC中GADD45B及FOS的mRNA表达，n=3。数据以均值±SD表示。P值采用单因素ANOVA并进行Newman–Keuls检验。*P<0.05，**P<0.01，表示差异具有统计学意义。
图9：TXL通过靶向GADD45B抑制CSE诱导的PMEC体外细胞衰老。（A）HPMEC衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色（上排）和DNA损伤标志物γ-H2AX免疫荧光染色（下排）的代表性图像。细胞分为4种处理条件：Control（未处理）、Scramble siRNA+CSE、GADD45B特异性小干扰RNA处理的siGADD45B+CSE组，以及siGADD45B+CSE+TXL联合处理组。比例尺=100 µm，n=3。（B–C）A中β-半乳糖苷酶（B）和γ-H2AX（C）的定量结果。P值采用单因素ANOVA并进行Newman–Keuls检验；γ-H2AX数据采用Kruskal–Wallis检验并进行Dunn多重比较检验。*P<0.05，**P<0.01，表示差异具有统计学意义。
人参皂苷Rg1可能是TXL靶向GADD45B发挥抗衰老作用的关键活性成分
为筛选TXL发挥抗PMEC衰老作用的关键成分，研究建立了“化学成分解析—网络药理学—分子对接—结合实验—细胞验证”的整合筛选策略。
首先采用LC-MS/MS结合深度质谱数据集关联桥接（Deep MDRB）平台解析TXL化学成分。通过数据库直接匹配和基于生物合成规则的推定鉴定，共鉴定1,565种化学成分，包括823种Level 1、547种Level 2和195种Level 3成分，其中29种通过对照品得到准确确认。
在183种高响应成分中，有128种成功获得相应作用靶点。进一步采用随机游走重启（Random Walk with Restart，RWR）算法计算成分靶点与疾病关键靶点之间的网络关联，最终发现68种化合物呈正相关；以Z-score>3作为显著关联标准后，筛选得到酸枣仁皂苷（spinosin）、香草醛（vanillin）、人参皂苷Rh1、人参皂苷Re和人参皂苷Rg1等5种候选成分。
分子对接显示，人参皂苷Rg1、spinosin、人参皂苷Rh1和人参皂苷Re与GADD45B均具有低于−5 kcal/mol的预测结合能。进一步采用生物层干涉（biolayer interferometry，BLI）直接检测分子结合发现，人参皂苷Rg1与GADD45B呈明显的浓度依赖性相互作用，解离常数KD为5.409 μM。相比之下，spinosin、人参皂苷Rh1和人参皂苷Re在相同条件下均表现出较弱且无法达到饱和的结合反应，估算KD均超过500 μM。因此，研究将人参皂苷Rg1确定为TXL中可能通过较强结合GADD45B发挥抗衰老作用的关键候选成分。
图10：筛选并验证TXL中通过结合GADD45B对抗CSE诱导HPMEC细胞衰老的活性成分。（A）TXL抗衰老有效成分综合筛选流程示意图。（B–C）对TXL化学成分进行表征；展示正离子模式（B）和负离子模式（C）的总离子流图（TIC）。通过数据库直接匹配和基于生物合成规则的推定鉴定，共鉴定1,565种化学成分，其中823种为Level 1（数据库直接匹配，红色节点）、547种为Level 2（绿色节点）、195种为Level 3（一/两步生物合成产物，蓝色节点）。（D）基于网络药理学筛选TXL成分库中与衰老相关基因调控关联评分最高的5种成分，Z-score>3。（E）候选化合物与GADD45B结合潜力的分子对接图，包括人参皂苷Rg1、spinosin、人参皂苷Rh1和人参皂苷Re，结合亲和力均<−5 kcal/mol。（F–I）TXL候选成分的BLI检测，包括人参皂苷Rg1（F）、人参皂苷Rh1（G）、人参皂苷Re（H）和spinosin（I）。
细胞实验进一步显示，TXL和人参皂苷Rg1均可显著降低CSE诱导的β-半乳糖苷酶和γ-H2AX水平。RT-qPCR显示，人参皂苷Rg1还可明显抑制CSE引起的P21、P16和IL-1β升高，其作用幅度与TXL相近。
图11：人参皂苷Rg1是TXL对抗CSE诱导HPMEC衰老的主要活性单体候选成分。（A–B）验证人参皂苷Rg1对细胞衰老的保护作用。展示Control、CSE、CSE+TXL以及CSE+人参皂苷Rg1组SA-β-gal染色的代表性图像（A）和定量结果（B）。比例尺=100 µm，n=3。（C–D）γ-H2AX焦点的免疫荧光图像（C）和定量分析（D）。比例尺=100 µm，n=3。（E）采用RT-qPCR检测Control、CSE、TXL和人参皂苷Rg1组HPMEC中P21、P16、IL-1β和TNF-α的mRNA表达。数据以均值±SD表示。P值采用单因素ANOVA并进行Newman–Keuls检验。*P<0.05，**P<0.01，表示差异具有统计学意义。
为进一步验证GADD45B是否介导TXL及Rg1的作用，研究在HPMEC中过表达GADD45B。结果显示，GADD45B过表达明显削弱TXL和人参皂苷Rg1的抗衰老作用，包括减弱其对CSE诱导β-半乳糖苷酶活性的抑制、削弱对γ-H2AX表达的降低，以及减弱P16和P21下调作用。这进一步支持人参皂苷Rg1通过GADD45B发挥PMEC抗衰老作用。
图12：人参皂苷Rg1通过GADD45B延缓CSE诱导的HPMEC衰老。（A–B）HPMEC中SA-β-gal染色的代表性图像（A）和定量结果（B）。实验组包括Vector对照、CSE+Vector、GADD45B过表达+CSE（GADD45B-OE+CSE）、GADD45B-OE+CSE+TXL以及GADD45B-OE+CSE+人参皂苷Rg1组。比例尺=100 µm，n=3。（C–D）HPMEC中DNA损伤标志物γ-H2AX免疫荧光染色的代表性图像（C）及定量结果（D），实验分组同上。比例尺=100 µm，n=3。（E–F）RT-qPCR检测Vector、Vector+CSE、CSE+GADD45B-OE、TXL+CSE+GADD45B-OE以及人参皂苷Rg1+CSE+GADD45B-OE组HPMEC中P21和P16的mRNA水平，n=3。数据以均值±SD表示。P值采用单因素ANOVA并进行Newman–Keuls检验。*P<0.05，**P<0.01，表示差异具有统计学意义。
体内验证TXL通过GADD45B/FOS-MAPK轴抑制肺组织细胞衰老
最后，研究采用Western blot检测CS暴露12周C57BL/6J小鼠肺组织中的GADD45B/FOS-MAPK通路关键蛋白以及衰老相关蛋白。
与Control组相比，CS暴露显著提高FOS、GADD45B、P38、P21和P16蛋白表达，而TXL可明显抑制上述蛋白的升高。这些结果从体内层面进一步验证，TXL可能通过干预GADD45B/FOS-MAPK信号轴减轻CS诱导的肺组织细胞衰老。
图13：TXL对MAPK信号通路关键蛋白及细胞衰老标志物治疗作用的体内验证。（A）C57BL/6J小鼠肺组织中MAPK信号通路关键蛋白FOS、GADD45B和P38，以及细胞衰老标志物P16和P21的代表性Western blot图像。小鼠分别为空气暴露12周的Control组、CS暴露12周的CS组，以及CS暴露同时接受TXL治疗的TXL组，n=3。（B–F）根据A中的Western blot结果，对FOS（B）、GADD45B（C）、P38（D）、P16（E）和P21（F）蛋白水平进行定量，并以GAPDH进行归一化。
【贡献】★★★★★
本研究阐明了PMEC衰老参与COPD进展的一种新的潜在机制，即GADD45B-MAPK信号轴可能连接肺微血管内皮细胞衰老与COPD病理进程，并可作为潜在干预靶点。
TXL及其活性成分人参皂苷Rg1能够减轻PMEC衰老及其相关病理改变。其中，人参皂苷Rg1与GADD45B的直接相互作用以及后续细胞实验进一步支持其参与TXL抗衰老作用。上述发现进一步拓展了对COPD内皮细胞衰老机制的认识，并为后续探索TXL及其活性成分在人群COPD中的应用提供实验依据。
作者同时指出，目前研究仍存在若干局限，包括ERCC1±为全身性杂合敲除模型，无法将全部表型单独归因于PMEC衰老；研究未设置COPD标准治疗药物作为阳性对照；TXL调控GADD45B的上游机制尚未明确；除人参皂苷Rg1外，TXL其他成分的贡献仍需进一步解析；此外，人参皂苷Rg1在体内的药代动力学、长期有效性和安全性仍需要更多临床前研究验证。因此，目前结果主要支持动物和细胞层面的机制证据，尚不能直接等同于人体COPD治疗效果。
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