APPS | 桃疏果中α-葡萄糖苷酶抑制性低聚糖的制备、鉴定及IR-HepG2细胞活性研究|α-葡萄糖苷酶|多糖|桃疏果|活性|甘露|细胞|聚糖

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Abstract

本研究以桃疏果粗多糖（CPPS）中的关键降糖低聚糖组分为研究对象，解析其结构特征与降糖作用机制，同时提升该农业副产物的资源化利用率。采用阴离子交换色谱结合超滤技术对CPPS进行分离纯化，筛选得到W1-2、W2-2两种高活性组分，二者均具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值分别为 0.57 mg/mL、0.37 mg/mL。两种活性组分均可显著改善胰岛素抵抗 HepG2 细胞（IR-HepG2）的葡萄糖消耗量、糖原合成量，提高己糖激酶与丙酮酸激酶的活性。液相色谱-质谱联用（LC-MS）及甲基化结构分析表明：W1-2含二糖和五糖结构，二糖是由半乳糖或葡萄糖通过1,4 -糖苷键与末端阿拉伯糖相连，五糖则由T-Araf、1,5-Araf、1,3,5-Araf构成。W2-2中类海藻糖二糖占比高达76.95%，同时含有分支结构相近的阿拉伯糖五糖。研究结果表明，CPPS中的类海藻糖二糖与由阿拉伯糖构成的五糖是其发挥血糖调控作用的关键活性物质。本研究为生物活性多糖应用于糖尿病干预研究提供了重要理论依据。

Introduction

桃树因自然坐果率较高的原因，需人工疏果以摘除幼果优化养分，提升果实品质。我国每年疏果废弃量约125万 t，资源化利用程度极低，大多弃置田间，造成资源浪费和生物污染。如何将桃疏果开发转化为高附加值资源，已成为近年来的研究热点。桃疏果富含多酚、多糖等功能性活性成分，是极具开发潜力的未被充分利用高价值资源。目前国内外研究多集中于桃疏果多酚的生物活性，针对其多糖及低聚糖的相关研究仍较为匮乏。课题组前期动物实验已证实，桃疏果多糖对糖尿病模型小鼠具有降糖作用，具备用于糖尿病辅助调控的开发潜力。

低聚糖是由2~10 个单糖通过糖苷键连接而成的低聚合度糖类化合物的统称。低聚糖与多糖类似，普遍具有抗氧化、降血糖、降血脂及调节肠道菌群等生物活性。但相较于多糖，低聚糖具有分子量小、聚合度低、结构简单、生物利用度高等优势，更易被人体吸收利用，现已受到国内外学界的广泛关注。

近年来，尽管科技与医学发展迅速，但临床上糖尿病仍无法根治，仅能依靠药物干预控制血糖水平。与此同时，糖尿病患病率逐年攀升，已对人类健康构成严重威胁。目前，血糖调控主要依靠饮食调理、运动锻炼及药物干预3 种方式，人体摄入米面等高碳水食物后，可通过延缓这类食物的分解进程，避免餐后短时间内血糖急剧飙升。α-葡萄糖苷酶抑制剂即为一类可调控碳水化合物吸收的降糖药物。该类药物以小肠黏膜刷状缘上的α-葡萄糖苷酶为作用靶点，通过竞争性抑制酶活性，减缓肠道内淀粉水解与葡萄糖吸收速率，甚至可实现抑制效应最大化，进而降低餐后血糖水平。临床常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要包括阿卡波糖、米格列醇。此类降糖药物虽降糖效果显著，但存在副作用，并且患者耐受性差、干预成本偏高，已难以满足日益增长的糖尿病人群健康需求。低聚糖作为天然植物源功能性碳水化合物，具有低毒、安全性高的特点，是开发糖尿病功能性食品与膳食辅助干预制剂的优质候选物质，有望成为化学合成药物的理想替代品。因此，研发安全、天然的植物源降糖活性成分，应用于功能性食品开发与糖尿病辅助干预，已成为食品与医药领域的研究热点。

本研究以桃疏果粗多糖为原料，经阴离子交换层析与超滤纯化，筛选出具有显著降糖活性的组分；构建胰岛素抵抗 HepG2 细胞模型，通过相关指标评价其降糖效果，并采用多种方法解析其基本结构，为桃疏果的开发应用及天然降糖物质的发掘提供理论参考。

Result and Discussion

CPPS的分离

前期研究已证实CPPS具有显著降糖活性，但其关键活性组分尚不明确，因此有必要对CPPS进一步分离解析。如图1A所示，采用0、0.1、0.2、0.5 mol/L 氯化钠溶液对CPPS进行梯度洗脱，共得到5个组分，得率分别为9.28%、12.68%、34.46%、7.41%、7.00%。其中，纯水洗脱组分对α-葡萄糖苷酶的抑制率显著高于CPPS及其他组分，IC₅₀值为1.41 mg/mL（图1B）。进一步分离纯水洗脱组分得到W1、W2（图1C）；再经超滤分离后获得W1-2与W2-2。W1-2、W2-2抑制α-葡萄糖苷酶的IC₅₀分别为0.57、0.37 mg/mL，显著低于CPPS（图1D、1E）。由高效凝胶色谱图可见，W1-2和W2-2均呈现单一对称峰，组分均一（图1F、1G）。

图1 桃疏果低聚糖的制备。（A）CPPS洗脱曲线，（B）不同洗脱组分对α-葡萄糖苷酶的抑制率，（C）纯水洗脱组分的洗脱曲线，（D）W1-1、W1-2、W2-1、W2-2及CPPS 的α-葡萄糖苷酶抑制能力，（E）IC50值，（F）W1-2的分子量图谱，（G）W2-2的分子量图谱。

IR-HepG2细胞模型的构建

如图2A所示，采用不同浓度葡萄糖胺诱导HepG2细胞后，各组细胞葡萄糖消耗量均低于对照组，其中葡萄糖胺浓度为12 mmol/L时，细胞葡萄糖消耗量降至最低（P < 0.001）。因此选定12 mmol/L作为HepG2细胞胰岛素抵抗模型的最佳造模浓度。为确定最佳造模时长，以12 mmol/L葡萄糖胺分别处理HepG2细胞16、20和24 h，并检测葡萄糖消耗量。由图2B可见，与空白对照组相比，16、20、24 h处理组细胞葡萄糖消耗均显著降低（P < 0.01）；其中16 h处理组与空白组的葡萄糖消耗差异最大。同时考虑到造模时间过长易造成细胞密度过高、细胞形态异常，最终确定采用12 mmol/L葡萄糖胺处理16 h，建立稳定可靠的IR-HepG2细胞模型。

W1-2和W2-2对HepG2细胞存活率的影响

对于W1-2，随浓度升高细胞存活率呈现先上升后下降趋势，浓度低于2.0 mg/mL时，细胞存活率均维持在90%以上，超过2.0 mg/mL后存活率显著下降。因此选取0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL用于后续试验。对于W2-2，浓度在1.0 mg/mL以下时细胞存活率高于90%，超过1.0 mg/mL后存活率显著降至90%以下，表明高浓度W2-2具有明显细胞毒性。故后续实验选用0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL四个浓度梯度（图2C、2D）。

图2 （A）造模浓度，（B）造模时间，（C）W1-2的细胞毒性，（D）W2-2的细胞毒性。

W1-2和W2-2对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响

葡萄糖消耗量是判断细胞是否发生胰岛素抵抗的重要指标，也可作为改善胰岛素抵抗效果的评价依据。空白对照组为正常HepG2细胞，葡萄糖消耗量为7.91 mmol/L；模型组葡萄糖消耗量显著降至3.86 mmol/L，表明胰岛素抵抗造模效果良好、模型构建成功。图3A、3B分别对比了不同浓度W1-2、W2-2对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响。与模型组相比，0.5~2.0 mg/mL的W1-2可显著提升HepG2 细胞葡萄糖消耗，分别提升至模型组的1.47、2.29和2.46 倍；0.25～1.0 mg/mL的W2-2也能显著提高细胞葡萄糖消耗，分别达到模型组的1.60、2.19和2.16 倍。结果表明，W1-2与W2-2均可有效促进IR-HepG2细胞的糖代谢、改善细胞胰岛素抵抗，且无明显细胞毒性。

W1-2和W2-2对IR-HepG2细胞糖原合成含量的影响

糖原合成是由糖原合酶（GS）催化、将葡萄糖转化为糖原并储存于肝脏和肌肉中的生理过程。处于胰岛素抵抗状态时，PI3K-Akt 等胰岛素信号通路受损，致使糖原合酶激酶-3（GSK-3）活性升高，进而抑制糖原合酶活性，造成细胞无法正常合成糖原、有效储存葡萄糖，最终引发血糖升高。由图3C、3D 可知，与空白对照组相比，模型组细胞糖原含量显著降低（P < 0.05），说明胰岛素抵抗可干扰 HepG2 细胞的糖原合成功能。

以不同浓度的W1-2干预IR-HepG2细胞后，糖原含量整体呈上升趋势，其中 0.25、0.5、1.0 mg/mL 浓度组无显著差异，而2.0 mg/mL W1-2处理后糖原含量显著上调，为模型组的1.35 倍。对于W2-2，0.5 mg/mL与1.0 mg/mL处理后糖原含量均显著升高，分别达到模型组的1.23 倍、1.35 倍。上述结果表明，2.0 mg/mL W1-2以及0.5-1.0 mg/mL W2-2均可促进胰岛素抵抗 HepG2 细胞糖原合成、提升细胞糖原含量，证实桃疏果低聚糖能够有效改善胰岛素抵抗。

图3 （A）W1-2对细胞葡萄糖消耗量的影响，（B）W2-2对细胞葡萄糖消耗量的影响，（C）W1-2对细胞糖原含量的影响，（D）W2-2对细胞糖原含量的影响。

W1-2和W2-2对IR-HepG2细胞己糖激酶的影响

2型糖尿病的主要特征之一是机体糖代谢紊乱，促进葡萄糖分解代谢是防治2型糖尿病的重要途径。己糖激酶（HK）是糖代谢过程中的关键限速酶，可催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖。6-磷酸葡萄糖既可通过氧化磷酸化或糖酵解生成三磷酸腺苷（ATP），也可经磷酸戊糖途径参与核苷酸等中间代谢产物的合成。

如图4A、4B所示，与空白对照组相比，模型组HK活性显著降低，为279.92 U/104个细胞。经2.0 mg/mL W1-2作用后，HK活性升至332.38 U/104个细胞，较模型组升高18.74%。0.5 mg/mL、1.0 mg/mL W2-2处理后，HK活性较模型组分别提升17.31%、43.87%。结果表明，在适宜浓度下，W1-2与W2-2均可上调HK活性、加快葡萄糖磷酸化进程，促进细胞对葡萄糖的摄取与利用，进而发挥降血糖作用。

W1-2和W2-2对IR-HepG2细胞丙酮酸激酶的影响

丙酮酸激酶（PK）是糖代谢途径中的第三个关键限速酶，可专一催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）不可逆转化为丙酮酸，并生成1分子ATP，该反应对调控糖酵解速率具有重要作用。如图4C、4D所示，与对照组相比，模型组PK活性显著降低，仅为20.12 U/104细胞。经1.0、2.0 mg/mL的W1-2处理后，PK活性分别为31.01、30.49 U/10⁴细胞，较模型组分别升高54.13%、51.54%；经0.5、1.0 mg/mL W2-2处理后，丙酮酸激酶活性分别为28.92、34.75 U/10⁴细胞，较模型组分别升高43.74%、72.71%。上述结果表明，在较高浓度下，W1-2与W2-2可通过调控PK活性，改善细胞的胰岛素抵抗状态。

图4 （A）W1-2对细胞己糖激酶的影响，（B）W2-2对细胞己糖激酶的影响，（C）W1-2对细胞丙酮酸激酶的影响，（D）W2-2对细胞丙酮酸激酶的影响。

W1-2和W2-2的液质分析

采用液质联用（LC-MS）对W1-2、W2-2的低聚糖组成进行分析。如图5A、5B所示，在W1-2中检测到分子量为313 Da和679 Da的低聚糖，分别对应1分子己糖+ 1分子戊糖构成的二糖（分子式C11H20O10），以及由5分子戊糖构成的五糖（分子式C25H42O21）。W2-2中检测到分子量343 Da和679 Da的低聚糖，提示其含有2分子己糖组成的二糖（分子式C12H22O11）与5分子戊糖构成的五糖（分子式C25H42O21）（图5C、5D）。以上结果表明，W1-2与W2-2均为低聚糖混合物，主要由二糖和五糖组成。但W1-2、W2-2的高效凝胶色谱（HPGPC）图谱均呈单一对称峰，说明2 种组分中的二糖与五糖在色谱洗脱过程中的保留时间高度重叠，难以实现有效分离。

图5 （A，B）W1-2的液质图谱，（C，D）W2-2的液质图谱

W1-2和W2-2的单糖组成

不同低聚糖生物活性存在差异，主要归因于单糖组成不同。单糖的种类与含量差异会直接影响糖苷键的类型和空间构型，进而改变其生理活性。如图6A所示，葡萄糖和阿拉伯糖在W1-2与W2-2中均占有较高比例。W1-2主要由9 种单糖组成，主要成分为葡萄糖（29.74%）、阿拉伯糖（23.47%）、氨基葡萄糖（18.43%）、半乳糖（11.1%）、果糖（7.91%）、甘露糖（6.82%）、半乳糖胺（2.54%）。图6B为W2-2的单糖组成，其主要成分为葡萄糖（86.95%）、阿拉伯糖（7.39%）、半乳糖（3.53%）、甘露糖（1.28%）和果糖（0.85%）。具有降糖活性的低聚糖通常含有葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖。已有研究表明，高含量的阿拉伯糖有利于增强低聚糖的降糖活性。本研究中，W1-2中葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖三者总占比为64.30%，W2-2中占比为97.87%。

图6 （A）W1-2的单糖组成，（B）W2-2的单糖组成

W1-2和W2-2的甲基化的分析

单糖的连接方式与分支结构对低聚糖的生物活性具有显著影响。低聚糖的生物活性与各类糖苷键密切相关，糖苷键决定了低聚糖分子链的局部空间构象。W1-2的甲基化产物有葡萄糖残基、半乳糖残基和阿拉伯糖残基，占比分别为42.54%、30.74%、26.73%（表1）。W2-2经甲基化裂解后，检出葡萄糖残基、阿拉伯糖残基、半乳糖残基及甘露糖残基，占比依次为76.95%、10.60%、3.90%、8.56%，与单糖组成结果一致（表2）。

近年来大量研究表明，多数具有降糖活性的低聚糖均含有1→3、1→4、1→6型糖苷键。W1-2含有1→4型糖苷键，占总糖苷键比例达42.57%，这可能是其具有降糖活性的重要原因之一。值得注意的是，W2-2中单糖组成中葡萄糖占比高达86.95%，糖残基以端基葡萄糖（T-Glcp）为主（76.95%），即使其余残基均与端基葡萄糖连接形成二糖，端基葡萄糖占比仍处于较高水平。两分子葡萄糖可通过α-(1→1)糖苷键连接形成海藻糖，海藻糖具有良好的降糖活性。结果表明，W2-2中可能含有端基葡萄糖构成的类海藻糖二糖，使得该组分具有较强的降糖作用。W1-2与W2-2中还含有大量阿拉伯糖残基。L-阿拉伯糖是天然存在的戊糖，广泛分布于植物细胞壁中，大多以非淀粉多糖形式存在。L-阿拉伯糖可以非竞争性抑制小肠黏膜α-葡萄糖苷酶活性，且对蔗糖酶具有良好选择性，能够降低餐后血糖，同时不会增加胰岛负荷，对维持机体血糖稳态具有重要作用。

表1 W1-2的甲基化分析

表2 W2-2的甲基化分析

Conclusion

CPPS经分离得到多个组分，α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选得到W1-2、W2-2两个降糖关键组分。细胞实验结果表明，W1-2与W2-2可显著提升IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗量与糖原合成量，激活己糖激酶和丙酮酸激酶活性，提高细胞葡萄糖利用效率，从而改善胰岛素抵抗状态。结构分析显示，W1-2和W2-2均由二糖和含有阿拉伯糖的五糖组成，含T-Araf、1,5-Araf、1,3,5-Araf糖残基。其中W1-2的二糖由半乳糖或葡萄糖通过1,4-糖苷键与末端阿拉伯糖相连；W2-2中的二糖则是以T-Glcp构成的类海藻糖二糖。CPPS中的类海藻糖二糖与阿拉伯糖五糖是其调控血糖的关键活性结构，具有重要的代谢调控价值。本研究不仅桃为疏果在食品与医药领域的开发应用提供理论依据，也为从天然资源中发掘新型降糖活性物质提供了研究参考。

第一作者简介

黄雨泽，女，宁波大学食品科学与工程学院2022级硕士研究生，主要研究方向为果蔬功能成分研究。

通信作者简介

邵兴锋，博士/教授/博导，宁波大学食品科学与工程学院院长，浙江-马来西亚农产品加工与营养健康联合实验室主任，农产品质量安全全国重点实验室PI，美国Cornell University访问学者。担任双一区TOP期刊《Postharvest Biology and Technology》副主编，《Food Microbiology》《Plant Growth Regulation》《Journal of Future Food》《食品科学》等期刊编委。兼任浙江省食品学会副理事长、中国农学会农产品物流分会副主任委员等。从事果蔬采后生物学、物流保鲜与精深加工等方面的研究，已先后主持国家自然科学基金（7 项，含1 项区域创新重点项目）、浙江省杰出青年基金、浙江省重点研发计划、宁波市重点研发等20余项；以第一作者或通信作者发表SCI/EI收录90余篇，授权发明专利17 件（含美国发明专利1件），参与编制国家/行业标准3 项。先后荣获浙江省自然科学二等奖（1/5）、教育部科技进步一等奖（3/16）、中国商业联合会特等奖（1/9）、中国食品科学技术学会青年科技奖，入选农业农村部神农青年英才、浙江省科技创新领军人才、浙江省杰青等，2024和2025年全球前2%顶尖科学家。主持浙江省一流课程《食品贮运学》、浙江省“十四五”研究生教育改革项目。主编出版《食品贮运学》（中国轻工业出版社，2025年6月）。所指导研究生论文荣获浙江省优秀硕士论文2 篇、浙江省专业学位优秀实践成果5 项。

叶建芬，女，工学博士，宁波大学食品科学与工程学院讲师，主要围绕植物多糖来开展果蔬采后贮藏、保鲜以及精深加工、应用等方向研究工作。以第一作者和共同通信在Carbohydrate Plomyers，Food Hydrocolloids，LWT-Food Science and Technology，International Journalof Biological Macromolecules等期刊发表SCI论文11篇，获得国自然青年基金和横向项目等资助。

-Glucosidase inhibitory oligosaccharides derived from thinned peach fruit: preparation, identification, and effects on IR-HepG2 cellsYuze Huang, Jianfen Ye*, Yingying Wei, Shu Jiang, Yi Chen & Xingfeng Shao*

Zhejiang-Malaysia Joint Research Laboratory for Agricultural Product Processing and Nutrition, College of Food Science and Technology, Ningbo University, Ningbo, 315800, China

*Corresponding authors.

Abstract

In this study, we focused on the key hypoglycemic oligosaccharide components derived from thinned peach crude polysaccharides (CPPS), elucidated their structural characteristics and hypoglycemic mechanisms, and improved the utilization of this agricultural waste. CPPS was fractionated via anion-exchange chromatography and ultrafiltration, yielding 2 key components (W1-2 and W2-2) with enhanced α-glucosidase inhibition and half maximal inhibitory concentration (IC50) were 0.57 and 0.37 mg/mL, respectively. They improved glucose consumption, glycogen synthesis, hexokinase, and pyruvate kinase activities in insulin resistant HepG2 cells. Structural analysis using LC-MS and methylation revealed W1-2 contains disaccharides where galactose or glucose is linked to terminal arabinose through 1,4-glycosidic bonds, alongside arabinose-rich pentasaccharides featuring T-Araf, 1,5-Araf and 1,3,5-Araf residues. W2-2 comprises trehalose-like disaccharides with accounting for 76.95% of T-Glcp and arabinose pentasaccharides with similar branching patterns. These findings suggest that trehalose-like disaccharides and arabinose-derived pentasaccharides in CPPS may play a key role in blood glucose regulation. This study offers important insights into the roles of bioactive carbohydrates in diabetes intervention.

Reference:

Huang, Y., Ye, J., Wei, Y. et al. α-Glucosidase inhibitory oligosaccharides derived from thinned peach fruit: preparation, identification, and effects on IR-HepG2 cells. Agric. Prod. Process. Sto. 2, 43 (2026). https://doi.org/10.1007/s44462-026-00077-1.

文章编译由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片来源：摄图网

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