2026年8月13日，徐州医科大学附属医院陆远、Jue Xi团队联合徐州医科大学第一临床学院、基础医学院及丰县人民医院等单位，在Phytomedicine（中科院1区，IF=11.3）在线发表题为“A novel polysaccharide from Ligusticum chuanxiong attenuates cardiac hypertrophy by targeting ferroptosis through the SIRT3-mediated deacetylation of Foxo3a”的研究论文。Lei Chen 和 Zhuang Chen 为共同第一作者，陆远和Jue Xi为通讯作者。该研究于2026年4月5日投稿，7月23日修回，8月11日正式接收。
该研究从川芎（Ligusticum chuanxiong）根茎中分离并鉴定出一种新的均一多糖 FL-D2N1。结构分析显示，FL-D2N1 是一种高度支化的半乳聚糖型多糖，重均分子量约94.38 kDa，在水溶液中呈紧密的近球形构象。其主链主要由→6)-β-D-Galp-(1→、→3)-β-D-Galp-(1→和→3,6)-β-D-Galp-(1→残基组成，并具有α-L-Araf-(1→等侧链。
在横主动脉缩窄（TAC）诱导的压力超负荷小鼠模型中，FL-D2N1改善了心功能和心室重构，减轻心肌肥厚和纤维化，并抑制心肌铁死亡。进一步的转录组学和机制实验将线粒体去乙酰化酶 SIRT3 锁定为关键调控节点。FL-D2N1不仅提高SIRT3表达，还增强其去乙酰化酶活性，促进Foxo3a去乙酰化，并进一步调控抗氧化和抗铁死亡相关程序。
与此同时，FL-D2N1增强PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，上调线粒体融合蛋白MFN2，降低Drp1 Ser616磷酸化，改善线粒体超微结构、膜电位及呼吸功能，并减少线粒体ROS产生。在Ang II刺激的心肌细胞中敲低SIRT3后，FL-D2N1对铁死亡、线粒体自噬和线粒体稳态的保护作用均明显减弱，进一步支持SIRT3/Foxo3a轴在其作用机制中的关键地位。
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【摘 要】
背景：病理性心肌肥厚是心脏对压力超负荷产生的一种适应不良反应，并常进一步发展为心力衰竭，因此亟需寻找有效的干预策略。植物来源多糖因具有较好的安全性和多重生物活性，被认为是具有潜力的天然活性成分。川芎长期用于心血管疾病相关治疗，但其多糖的结构特征以及改善心肌肥厚的具体作用机制仍不明确。
目的：从川芎中分离并鉴定一种新型多糖，明确其结构特征，并阐明其对压力超负荷诱导心肌肥厚的保护作用及分子机制。
研究设计与方法：研究分离纯化获得均一多糖FL-D2N1，并通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、单糖组成分析、糖苷键连接方式分析、核磁共振（NMR）以及体积排阻色谱-多角度激光光散射-示差折光检测（SEC-MALLS-RI）等方法进行结构表征。
在体内实验中，采用横主动脉缩窄（transverse aortic constriction，TAC）建立压力超负荷诱导的心力衰竭小鼠模型，通过心功能、心肌肥厚、纤维化及铁死亡等指标评价FL-D2N1的心脏保护作用，并结合转录组学筛选关键作用通路。体外采用血管紧张素Ⅱ（Ang II）刺激心肌细胞，进一步考察线粒体功能、铁死亡、线粒体自噬、线粒体动力学及能量代谢变化。最后利用药理学工具、免疫荧光、免疫共沉淀和SIRT3 siRNA等手段验证SIRT3/Foxo3a信号轴。
结果：研究成功从川芎根茎中分离得到一种新的半乳聚糖型多糖FL-D2N1，其重均分子量为94.376 kDa，在水溶液中呈紧密的球形构象。结构分析显示，FL-D2N1具有高度支化结构，其主链主要由→6)-β-D-Galp-(1→、→3)-β-D-Galp-(1→和→3,6)-β-D-Galp-(1→残基组成，并以α-L-Araf-(1→等结构作为侧链。
在TAC小鼠中，FL-D2N1显著改善心功能，减轻心室重构、心肌肥厚和纤维化，同时抑制心肌铁死亡，表现为丙二醛（MDA）及铁蓄积减少、谷胱甘肽（GSH）水平恢复。
转录组学结合机制实验进一步将SIRT3确定为FL-D2N1发挥心脏保护作用的关键调控节点。FL-D2N1不仅上调SIRT3表达，同时增强其去乙酰化酶活性，从而促进Foxo3a去乙酰化，并进一步调节抗氧化和抗铁死亡相关转录程序。
功能上，FL-D2N1促进PINK1/Parkin介导的线粒体自噬；通过上调MFN2并降低Drp1 Ser616磷酸化恢复线粒体动力学平衡；同时保护线粒体超微结构和膜电位，减少线粒体活性氧（ROS）过度产生，并改善线粒体呼吸功能。
值得注意的是，使用特异性siRNA沉默SIRT3后，FL-D2N1对铁死亡的抑制作用、对线粒体自噬的促进作用以及对线粒体结构和功能的保护作用均明显减弱，从而进一步证实SIRT3/Foxo3a轴在FL-D2N1作用机制中的关键地位。
结论：FL-D2N1是一种来源于川芎的新型半乳聚糖，可通过SIRT3/Foxo3a信号轴抑制铁死亡并维持线粒体质量控制，从而减轻病理性心肌肥厚。研究提示，这种结构明确的天然多糖具有进一步开展心肌肥厚和心力衰竭干预研究的潜力。
01
研究背景及科学问题
持续性压力超负荷引起的病理性心肌肥厚是一种适应不良性心脏重构，也是心力衰竭发生的重要前兆，并在全球范围内造成显著的疾病负担和死亡风险。虽然心肌肥厚在早期可作为代偿机制帮助维持心输出量，但随着病程进展，这一代偿性程序最终可导致心室功能障碍并进一步发展为明显的心力衰竭。
目前针对慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）的指南推荐药物虽然能够缓解症状并延缓疾病进展，但对于已经形成的病理性心脏重构往往难以实现逆转，同时部分治疗还存在不良反应风险。因此，寻找能够针对病理性心肌肥厚及其向心力衰竭转变核心机制的新型干预策略仍具有重要意义。
线粒体功能障碍位于慢性心力衰竭发病机制的核心位置，其主要表现包括能量代谢受损、活性氧水平升高以及细胞命运调控异常。这些功能性缺陷通常还伴随着明显的线粒体结构改变，从而进一步损害心脏功能。
线粒体质量控制主要依赖线粒体融合、分裂以及线粒体自噬之间的协调调节。其中，PINK1/Parkin通路是线粒体自噬的核心机制之一，能够识别并标记受损线粒体，随后将其送入自噬降解程序。当线粒体发生去极化时，PINK1在线粒体膜上稳定积聚并招募Parkin，进一步促进相关蛋白泛素化，从而清除受损线粒体。
与此同时，线粒体融合与分裂之间的动态平衡对于维持线粒体网络完整性同样至关重要。MFN2表达降低以及Drp1 Ser616位点磷酸化升高通常可导致过度线粒体分裂，并进一步加重心功能异常。
越来越多研究发现，铁死亡（ferroptosis）——一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的调控性细胞死亡形式——同样参与心肌肥厚及心力衰竭的发生发展。
铁死亡在生化特征上不同于细胞凋亡和程序性坏死，其主要表现包括谷胱甘肽耗竭、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）失活以及脂质过氧化物蓄积。线粒体在铁死亡过程中具有双重作用：一方面可生成脂质过氧化所需底物，另一方面本身又是铁死亡损伤的重要靶点。这种双重作用进一步说明线粒体功能障碍与铁死亡之间存在密切联系。
沉默信息调节因子3（sirtuin 3，SIRT3）是线粒体内关键的NAD+依赖性去乙酰化酶，可调节多种维持细胞能量代谢及存活所必需的稳态过程。
SIRT3可通过直接去乙酰化并激活PINK1促进线粒体自噬，同时通过稳定线粒体融合蛋白MFN2维持线粒体网络完整性。SIRT3活性降低可加重线粒体碎片化并加速功能衰退，因此其在病理性心脏重构、心肌肥厚及纤维化过程中具有重要调节作用。
近年来还有研究提示，SIRT3能够通过去乙酰化Foxo3a参与铁死亡调控。Foxo3a作为重要转录因子，可进一步控制GPX4、SLC7A11等抗氧化及铁死亡相关基因。因此，提高SIRT3活性可能同时作用于线粒体稳态、铁死亡及心力衰竭进程。
天然多糖因安全性较好且具有多种生物活性，近年来在功能食品、营养及心血管疾病研究领域受到广泛关注。
川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）是一种具有长期药用历史的传统药材，也是多种生物活性多糖的重要来源。既往研究显示，川芎多糖具有抗氧化、抗缺血等作用，并可能减轻氧化应激和心肌细胞损伤。
然而，具有生物活性的川芎多糖究竟具有怎样的精细结构，以及其是否能够通过SIRT3介导的线粒体质量控制和铁死亡调节作用于慢性心力衰竭，目前仍缺乏系统研究。
因此，本研究从川芎中分离并结构鉴定一种新的均一多糖FL-D2N1，并重点评价其对压力超负荷诱导心肌肥厚及随后心力衰竭的保护作用，同时围绕SIRT3/Foxo3a去乙酰化轴，进一步阐明其调控线粒体质量控制及铁死亡的分子机制。
02
重要发现及亮点
川芎多糖FL-D2N1的分离纯化及基本结构特征
研究首先采用热水提取和乙醇沉淀，从干燥川芎根茎中获得粗多糖FL。粗多糖得率为8.5%，总多糖含量为54.8%。
为了获得均一多糖，研究进一步进行两步色谱纯化。首先采用DEAE Sepharose阴离子交换柱分级，以0.1 M NaCl洗脱获得主要组分FL-D2；随后采用Sephacryl S-400 HR凝胶过滤柱进行进一步纯化，获得单一对称洗脱峰，对应均一多糖FL-D2N1。
FT-IR分析显示，FL-D2N1具有典型多糖结构特征。3429 cm⁻¹处出现宽而强的吸收峰，对应O–H伸缩振动，提示分子中存在广泛的分子间和分子内氢键。2922 cm⁻¹处的较弱吸收峰对应亚甲基和次甲基中的C–H伸缩振动。
指纹区最明显吸收峰位于1077 cm⁻¹，对应C–O–C和C–O–H伸缩振动，是糖苷键及环醚结构的典型信号。1740 cm⁻¹和1650 cm⁻¹附近没有明显吸收峰。1315.7 cm⁻¹处出现中等强度峰，对应羟基O–H面内弯曲振动；1384.12 cm⁻¹附近还可观察到脂肪链C–H面内弯曲振动。
图1：纯化川芎多糖FL-D2N1的结构表征。（A）傅里叶变换红外光谱（FT-IR）；（B）采用气相色谱测定单糖组成；（C）体积排阻色谱联合多角度激光光散射（SEC-MALLS）洗脱曲线，用于测定绝对分子量；（D）根据SEC-MALLS数据得到的构象图，用于显示FL-D2N1在水溶液中的分子形态。
单糖组成分析显示，FL-D2N1由6种单糖构成，分别为阿拉伯糖37.46%、鼠李糖2.61%、半乳糖54.19%、葡萄糖0.86%、半乳糖醛酸4.06%和葡萄糖醛酸0.82%。其中半乳糖含量最高，提示FL-D2N1以半乳糖结构为主。
SEC-MALLS-RI结果显示单一对称峰，说明该多糖纯度及均一性较好。FL-D2N1的重均分子量（Mw）为94.38 kDa，数均分子量（Mn）为93.52 kDa，多分散指数Mw/Mn仅为1.009，提示其分子量分布十分集中。
由光散射数据计算得到的构象曲线斜率α为0.25，提示FL-D2N1在水溶液中形成紧密的近球形构象。
糖苷键组成分析进一步揭示FL-D2N1具有高度支化的半乳聚糖骨架。研究共鉴定出12种不同糖苷连接方式，其中末端阿拉伯呋喃糖基占24.26%，提示分子具有较高支化程度。
主要骨架连接形式包括→6)-Gal(p)-，占16.28%，以及→3,6)-Gal(p)-，占18.38%，提示其具有以半乳聚糖为核心、并频繁在O-6位发生支化的结构。同时检测到→3,4,6)-Gal(p)-以及→3,5)-Ara(f)-等多取代残基，进一步说明FL-D2N1具有复杂的多分支结构。
NMR进一步解析FL-D2N1的精细结构
研究随后通过¹H NMR、¹³C NMR以及COSY、HSQC、HMBC和NOESY等一维及二维核磁共振技术解析FL-D2N1的精细结构。
¹H NMR在δ 3.0–5.5 ppm范围内呈现典型糖类质子信号，在δ 4.3–5.4 ppm异头区共观察到8个不同质子峰。结合¹³C NMR、HSQC、甲基化分析及已有结构信息，研究分别将这些残基鉴定为α-L-Araf-(1→、→3,6)-β-D-Galp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→、→3)-β-D-Galp-(1→、→4)-β-D-Galp-(1→、→3,5)-α-L-Araf-(1→、→5)-α-L-Araf-(1→以及3-OMe-β-D-Galp-(1→。
结合HMBC和NOESY中不同残基之间的相关信号，最终确定FL-D2N1主链主要由→3,6)-β-D-Galp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→和→3)-β-D-Galp-(1→组成；α-L-Araf-(1→等侧链连接于→3,6)-β-D-Galp-(1→残基O-3位以及其他取代位点。
图2：FL-D2N1的核磁共振光谱分析。（A）¹H NMR谱；（B）¹³C NMR谱；（C）COSY（¹H-¹H相关光谱）谱；（D）HSQC（异核单量子相干）谱；（E）HMBC（异核多键相关）谱；（F）NOESY（核Overhauser效应光谱）谱。所有光谱均以D₂O为溶剂，在25 ℃条件下使用600 MHz核磁共振仪采集。
扫描电子显微镜观察显示，FL-D2N1整体呈多孔、疏松聚集以及不规则碎片状结构。单个颗粒表面相对平滑，并进一步形成片层状或薄片状聚集体，其边缘不均匀且不规则。这种形貌提示FL-D2N1处于无定形、非晶态物理状态，与高分子量生物活性多糖常见的聚合及吸湿特性一致。
图3：FL-D2N1的推测结构及微观形貌。（A）FL-D2N1推测多糖结构示意图，显示半乳聚糖主链及侧链取代结构；（B–E）不同放大倍数下FL-D2N1的扫描电子显微镜图像：（B）500×、（C）1000×、（D）2000×、（E）5000×，显示其多孔和片层状聚集形态；（F、G）其他样品区域的代表性SEM图像，分别为（F）500×和（G）2000×，用于说明其形貌具有一致性。
FL-D2N1改善压力超负荷诱导的心功能障碍和心肌损伤
研究采用横主动脉缩窄（TAC）建立压力超负荷诱导的心力衰竭小鼠模型。FL-D2N1选择100、200和400 mg/kg三个给药剂量，这是基于预实验结果确定的：50 mg/kg未显示明显作用，而400和800 mg/kg的效果相近，因此最终将400 mg/kg设为最高剂量。
心脏超声结果显示，TAC显著降低左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）和每搏输出量（SV），同时增加左心室舒张末期容积（LV Vol;d）、左心室质量（LV Mass）和舒张期室间隔厚度（IVS;d）。
FL-D2N1能够明显逆转上述变化，改善心脏收缩功能并减轻病理性心室重构。各组超声检测期间心率没有明显差异，因此观察到的心功能改善并非由心率差异导致。
与此同时，FL-D2N1显著降低血液中心力衰竭标志物N末端B型利钠肽原（NT-proBNP）及心肌损伤标志物心肌肌钙蛋白T（cTn-T）。
H&E染色显示，FL-D2N1能够减轻TAC引起的肌原纤维排列紊乱、胞质空泡化以及炎症细胞浸润；Masson染色进一步显示，其可明显减少心肌间质胶原沉积和心肌纤维化。
图4：FL-D2N1改善压力超负荷诱导心力衰竭小鼠的心功能障碍和心肌损伤。（A）代表性M型超声心动图；（B）LVEF%、LVFS%及每搏输出量的统计结果（n=6）；（C）LV Vol;d、LV Mass和IVSd的统计结果（n=6）；（D）血清NT-proBNP和cTn-T含量（n=6）；（E）心脏组织H&E和Masson染色（n=3），比例尺=250 μm。数据以均值±SD表示。#<0.01，与Sham组相比；*P<0.05、**P<0.01，与TAC组相比。
FL-D2N1减轻心肌肥厚并抑制心肌铁死亡
与Sham组相比，TAC小鼠出现明显心脏增大，心脏重量、心重/体重比（HW/BW）以及心重/胫骨长度比（HW/TL）均升高，而FL-D2N1能够显著减轻这些心肌肥厚表型。
与此同时，TAC显著诱导ANP、BNP和MYH7等心肌肥厚相关基因表达，而FL-D2N1可明显逆转其上调。麦胚凝集素（WGA）染色也显示，FL-D2N1能够明显降低心肌细胞横截面积。
进一步分析铁死亡发现，TAC使心肌组织丙二醛（MDA）水平显著升高、还原型谷胱甘肽（GSH）明显下降，并伴随心肌铁蓄积增加；FL-D2N1能够显著逆转上述改变。
在分子水平，FL-D2N1提高铁死亡抑制因子GPX4的表达，并调节SLC7A11和PTGS2 mRNA水平。免疫组化进一步显示，FL-D2N1增强GPX4蛋白表达，同时降低ACSL4和铁蛋白重链（FHC）水平。上述结果支持FL-D2N1通过抑制心肌铁死亡减轻压力超负荷诱导的心肌肥厚。
图5：FL-D2N1通过抑制心肌铁死亡减轻压力超负荷诱导的心肌肥厚。（A）完整心脏的代表性外观（n=6）；（B）心重/体重比（HW/BW，n=6）；（C）心重/胫骨长度比（HW/TL，n=6）；（D）TAC术后小鼠ANP mRNA水平（n=6）；（E）BNP mRNA水平（n=6）；（F）MYH7 mRNA水平（n=6）；（G）麦胚凝集素（WGA）染色的心脏横切面，比例尺=50 μm；（H）小鼠心脏WGA染色统计结果（n=5）；（I）MDA含量（n=6）；（J）GSH含量（n=6）；（K）心肌铁含量（n=6）；（L）TAC术后小鼠GPX4 mRNA水平（n=6）；（M）SLC7A11 mRNA水平（n=6）；（N）PTGS2 mRNA水平（n=6）；（O）GPX4、ACSL4和铁蛋白重链（FHC）蛋白表达的代表性免疫组织化学染色（n=5），比例尺=200 μm。数据以均值±SD表示。#<0.01，与Sham组相比；*P<0.05、**P<0.01，与TAC组相比。
FL-D2N1通过增强线粒体自噬和恢复线粒体动力学维持线粒体质量控制
为进一步解析FL-D2N1抑制心肌肥厚和铁死亡的机制，研究对TAC组和TAC+FL-D2N1组心肌组织进行转录组测序。
差异表达分析显示，FL-D2N1处理后MFN2和SIRT3表达显著升高。KEGG等通路分析进一步发现，差异基因主要富集于线粒体自噬、线粒体融合以及氧化磷酸化等过程，提示线粒体质量控制可能是FL-D2N1发挥心脏保护作用的核心机制之一。
蛋白互作网络进一步将SIRT3鉴定为与多种线粒体功能模块相连接的核心枢纽基因。
机制验证显示，TAC使心肌中PINK1和Parkin明显下降，而FL-D2N1可恢复二者水平。分离线粒体组分后的Western blot进一步显示，FL-D2N1促进PINK1和Parkin向线粒体转位，提示PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬被激活。
与此同时，FL-D2N1上调线粒体融合蛋白MFN2，并抑制促分裂蛋白Drp1 Ser616位点磷酸化，从而改善线粒体融合/分裂失衡。
透射电子显微镜显示，TAC导致线粒体嵴破坏和明显肿胀，而FL-D2N1能够较好维持线粒体超微结构，并改善线粒体长短轴比、每视野线粒体数量以及平均线粒体长度。
MitoSOX免疫荧光还显示，FL-D2N1显著减少心肌组织线粒体ROS积累。
图6：FL-D2N1通过增强线粒体自噬并恢复线粒体动力学，维持TAC小鼠心脏中的线粒体质量控制。（A）差异表达基因聚类热图；（B）差异表达基因KEGG功能富集分析；（C）PINK1和Parkin表达的免疫组织化学图像及统计分析（n=5），比例尺=200 μm；（D）心脏组织线粒体组分中PINK1和Parkin蛋白表达的Western blot图像及统计分析（n=5）；（E）心脏组织MFN2和p-Drp1蛋白表达的Western blot图像及统计分析（n=5）；（F）MFN2和p-Drp1（Ser616）表达的免疫组织化学图像及统计分析（n=5），比例尺=200 μm；（G）电子显微镜超微结构分析，并检测线粒体长轴/短轴比及平均线粒体数量（n=5）；（H）平均线粒体长度（n=5）；（I）心脏组织线粒体ROS产生的免疫荧光检测结果（n=5），比例尺=50 μm。数据以均值±SD表示。<0.05、#<0.01，与Sham组相比；*P<0.05、**P<0.01，与TAC组相比。
FL-D2N1激活SIRT3/Foxo3a信号轴
基于转录组及蛋白互作网络分析，SIRT3被确定为连接线粒体自噬、线粒体动力学和铁死亡的关键枢纽，因此研究进一步验证SIRT3/Foxo3a信号轴。
免疫荧光显示，TAC显著降低心肌SIRT3表达，而连续4周给予FL-D2N1能够明显恢复SIRT3水平。同时，FL-D2N1还增加Foxo3a表达。
免疫组织化学分析进一步证实，FL-D2N1能够显著提高TAC小鼠心肌组织中的SIRT3和Foxo3a蛋白水平。
FL-D2N1同时显著提高TAC小鼠心脏中的Sirt3和Nrf2 mRNA水平。作者据此提出，FL-D2N1可能在转录水平上调SIRT3，并可能与NRF2激活有关。
进一步采用表面等离子共振（SPR）分析FL-D2N1与SIRT3之间的相互作用，结果显示二者存在直接结合信号，KD为2.86×10⁻⁶ M。由此，研究认为FL-D2N1能够激活压力超负荷心脏中的SIRT3/Foxo3a信号轴。
图7：FL-D2N1上调SIRT3及其下游信号，从而改善TAC诱导的线粒体功能障碍。（A）心脏组织SIRT3代表性免疫荧光图像，比例尺=50 μm；（B）心脏组织Foxo3a代表性免疫荧光图像，比例尺=50 μm；（C）SIRT3荧光强度定量分析（n=5）；（D）Foxo3a荧光强度定量分析（n=5）；（E）SIRT3表达的免疫组织化学图像，比例尺=200 μm；（F）SIRT3表达统计分析（n=5）；（G）Foxo3a表达的免疫组织化学图像，比例尺=200 μm；（H）Foxo3a表达统计分析（n=5）。数据以均值±SD表示。#<0.01，与Sham组相比；**P<0.01，与TAC组相比。
体外实验进一步证实FL-D2N1抑制铁死亡并维持线粒体功能
研究使用1 μM Ang II刺激心肌细胞48 h建立体外心肌肥厚模型。CCK-8实验首先确认，FL-D2N1浓度达到400 μg/mL时仍未观察到明显细胞毒性。
在Ang II刺激条件下，ANP、BNP和MYH7等心肌肥厚相关基因明显上调，而FL-D2N1能够显著抑制上述变化。
在铁死亡方面，FL-D2N1提高GPX4和SLC7A11 mRNA表达，并降低PTGS2表达；C11-BODIPY检测进一步显示，FL-D2N1能够明显减少Ang II诱导的脂质过氧化。
更重要的是，加入铁死亡诱导剂RSL3后，FL-D2N1对ANP和BNP的抑制作用明显被逆转，进一步支持其抗心肌肥厚效应与铁死亡抑制存在功能性联系。
在线粒体功能方面，FL-D2N1显著增加Ang II处理心肌细胞中的线粒体DNA（mtDNA）含量。JC-1染色显示，FL-D2N1逆转Ang II引起的线粒体膜电位（ΔΨm）下降；MitoSOX Red检测显示，其明显减少线粒体超氧阴离子过量生成。
Seahorse能量代谢分析进一步显示，FL-D2N1提高基础及应激状态下的氧耗率（OCR），改善线粒体呼吸，同时降低糖酵解及糖酵解能力相关的细胞外酸化率（ECAR）。
图8：FL-D2N1通过抑制铁死亡并维持线粒体功能减轻Ang II诱导的心肌细胞肥厚。（A）FL-D2N1对正常心肌细胞活力的影响（n=9）；（B）心肌细胞ANP mRNA水平（n=6）；（C）BNP mRNA水平（n=6）；（D）MYH7 mRNA水平（n=6）；（E）GPX4 mRNA水平（n=6）；（F）SLC7A11 mRNA水平（n=6）；（G）PTGS2 mRNA水平（n=6）；（H）采用qRT-PCR检测心肌肥厚标志物ANP mRNA水平（n=6）；（I）采用qRT-PCR检测心肌肥厚标志物BNP mRNA水平（n=6）；（J）相对mtDNA含量（n=6）；（K）采用JC-1检测线粒体膜电位及代表性免疫荧光图像，比例尺=20 μm；（L）采用MitoSOX检测线粒体ROS及代表性免疫荧光图像，比例尺=20 μm；（M）线粒体膜电位统计结果（n=5）；（N）ROS统计结果（n=5）；（O）线粒体氧耗率（OCR）；（P）基础OCR和应激OCR的统计分析（n=6）；（Q）细胞外酸化率（ECAR）；（R）糖酵解ECAR及糖酵解能力ECAR的统计分析（n=6）。数据以均值±SD表示。#<0.01，与Control组相比；*P<0.05、**P<0.01，与Ang II组相比。
FL-D2N1通过SIRT3/Foxo3a去乙酰化轴促进线粒体自噬并恢复线粒体动力学
在Ang II诱导的心肌肥厚细胞中，线粒体PINK1和Parkin转位明显下降，提示线粒体自噬受损；FL-D2N1处理后，线粒体PINK1和Parkin蛋白水平恢复。
同时，Ang II降低MFN2并促进Drp1 Ser616磷酸化，导致线粒体动力学向过度分裂方向偏移。FL-D2N1能够恢复MFN2表达并抑制Drp1 Ser616磷酸化，从而改善线粒体融合与分裂失衡。
进一步检测发现，FL-D2N1显著上调Ang II刺激心肌细胞中的SIRT3蛋白表达；免疫荧光同样观察到SIRT3信号增强。
更重要的是，FL-D2N1不仅提高SIRT3表达，还显著增强其去乙酰化酶活性。
免疫沉淀实验显示，Ang II使乙酰化Foxo3a明显增加，而FL-D2N1能够显著逆转这一变化，提示Foxo3a发生SIRT3相关去乙酰化。
双荧光素酶报告实验进一步显示，过表达Foxo3a可显著增强野生型GPX4和SLC7A11启动子驱动的荧光素酶活性，支持Foxo3a对抗铁死亡相关转录程序的调控作用。
图9：FL-D2N1激活SIRT3/Foxo3a去乙酰化轴，促进Ang II损伤心肌细胞的线粒体自噬并恢复线粒体动力学。（A）线粒体中PINK1蛋白表达的Western blot图像及统计分析（n=5）；（B）线粒体中Parkin蛋白表达的Western blot图像及统计分析（n=5）；（C）MFN2代表性荧光图像，比例尺=5 μm；（D）MFN2共定位统计结果（n=5）；（E）p-Drp1代表性荧光图像，比例尺=5 μm；（F）p-Drp1共定位统计结果（n=5）；（G）SIRT3 Western blot图像及统计分析（n=5）；（H）SIRT3（绿色）与线粒体（红色）的代表性共聚焦显微镜图像，比例尺=5 μm；（I）SIRT3荧光强度统计结果；（J）FL-D2N1提高Ang II损伤心肌细胞中的SIRT3酶活性（n=5）；（K、L）从FL-D2N1处理的Ang II损伤心肌细胞中免疫纯化Foxo3a，并采用乙酰化赖氨酸抗体（Ac-K）检测Foxo3a乙酰化水平（n=3）。数据以均值±SD表示。<0.05、#<0.01，与Control组相比；*P<0.05、**P<0.01，与Ang II组相比。
SIRT3是FL-D2N1抑制铁死亡和保护线粒体所必需的关键节点
为了验证SIRT3是否是FL-D2N1发挥保护作用所必需的分子，研究在Ang II刺激心肌细胞中使用SIRT3特异性siRNA进行功能缺失实验。
qRT-PCR验证显示，SIRT3 siRNA能够使Sirt3 mRNA表达降低约70%。
敲低SIRT3后，FL-D2N1抑制铁死亡的作用明显减弱。具体表现为，原本由FL-D2N1诱导的GPX4和SLC7A11表达升高明显受到抑制，同时FL-D2N1降低PTGS2表达的作用也显著减弱。
免疫荧光进一步显示，在对照siRNA细胞中，FL-D2N1能够明显增加PINK1和Parkin与线粒体的共定位；SIRT3沉默后，这一作用显著减弱，说明FL-D2N1促进受损线粒体自噬清除依赖于SIRT3。
同样，SIRT3敲低还显著削弱FL-D2N1对线粒体完整性的保护作用。FL-D2N1引起的mtDNA含量增加在SIRT3沉默后明显下降，进一步说明SIRT3对于FL-D2N1维持线粒体生成和功能同样具有关键作用。
此外，研究使用10 μM SIRT3激活剂厚朴酚（honokiol）进行验证。厚朴酚能够模拟FL-D2N1的作用，上调GPX4和SLC7A11、下调PTGS2；而二者联合处理并未出现进一步叠加效应。作者据此进一步支持FL-D2N1主要通过激活SIRT3发挥上述作用。
图10：SIRT3是FL-D2N1介导心肌细胞铁死亡抑制和线粒体保护所必需的。（A）心肌细胞GPX4 mRNA水平（n=6）；（B）SLC7A11 mRNA水平（n=6）；（C）PTGS2 mRNA水平（n=6）；（D）PINK1代表性荧光图像，比例尺=5 μm；（E）PINK1荧光强度统计结果（n=5）；（F）Parkin代表性荧光图像，比例尺=5 μm；（G）Parkin荧光强度统计结果（n=5）；（H）相对mtDNA含量（n=6）。**P<0.01，与NC+Ang II组相比。NS表示差异无统计学意义。
机制示意图总结：FL-D2N1通过SIRT3/Foxo3a轴连接铁死亡与线粒体质量控制
综合体内外结果，研究提出了FL-D2N1改善压力超负荷相关心肌肥厚的整体作用模式。
FL-D2N1首先提高SIRT3表达并增强SIRT3去乙酰化酶活性，进一步促进Foxo3a去乙酰化。该信号轴一方面参与调控GPX4、SLC7A11等抗铁死亡相关程序，从而减轻脂质过氧化和铁死亡；另一方面增强PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，并通过上调MFN2、降低Drp1 Ser616磷酸化恢复线粒体融合/分裂平衡。
由此，受损线粒体的清除得到改善，线粒体结构、膜电位和氧化磷酸化功能得到维持，同时线粒体ROS积累下降，最终减轻心肌细胞肥大、心室重构以及心功能障碍。
SIRT3敲低能够明显削弱上述作用，进一步支持SIRT3是FL-D2N1作用机制中的关键调控节点。
图11：一种来源于川芎的新型多糖通过SIRT3介导的Foxo3a去乙酰化调控铁死亡，从而减轻心肌肥厚。
【贡献】★★★★★
本研究成功从川芎根茎中分离并完成结构鉴定，获得一种新的半乳聚糖型多糖FL-D2N1。该多糖具有高度支化结构，并在水溶液中呈紧密的球形构象。
研究结果表明，FL-D2N1通过激活SIRT3/Foxo3a去乙酰化轴发挥心脏保护作用，并减轻压力超负荷诱导的心肌肥厚及心力衰竭。
机制上，FL-D2N1能够提高SIRT3表达及其酶活性，促进Foxo3a去乙酰化，继而抑制心肌铁死亡、增强PINK1/Parkin介导的线粒体自噬、恢复线粒体动力学平衡，并维持线粒体结构和功能。
SIRT3功能缺失实验进一步证实了这一通路的重要性：沉默SIRT3后，FL-D2N1的铁死亡抑制、线粒体自噬促进以及线粒体保护作用均明显减弱。
这些结果建立了结构明确的天然多糖与SIRT3依赖性铁死亡调节及线粒体质量控制之间此前尚未被充分认识的机制联系，同时为理解川芎多糖的结构—活性关系提供了新的实验依据。总体而言，研究将FL-D2N1提出为一种值得进一步研究的天然候选物，用于心肌肥厚和心力衰竭的预防与管理研究。上述结论目前主要建立在TAC小鼠和Ang II刺激心肌细胞等实验模型基础上。
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