打开一篇高分文章，经常能看到这样的图：UMAP、细胞聚类、FeaturePlot、DotPlot、拟时序、细胞通讯……
图 1：小编自己的
单细胞测序到底在「测」什么？和我们以前做的 RNA-seq 有什么区别？为什么一份组织经过单细胞测序以后，就能分出肿瘤细胞、T 细胞、巨噬细胞甚至不同的细胞亚群？今天我们来一起从最基本的逻辑开始，学习单细胞测序。
为什么需要单细胞测序？
传统转录组的一个重要局限：它能够告诉我们「组织发生了什么变化」，却很难回答「到底是哪类细胞发生了变化」。而单细胞 RNA 测序的核心价值，就是给我们一个确定答案。
假设我们拿到一块肿瘤组织。这块组织虽然看起来只有几毫米，但里面包含大量不同类型的细胞：肿瘤细胞，T 细胞，B 细胞，巨噬细胞，成纤维细胞，内皮细胞，平滑肌细胞，其他基质细胞等。
传统 RNA 测序，也就是常说的 bulk RNA-seq，通常是把整块组织中的 RNA 提取出来以后一起测。得到的结果是：这块组织中，每个基因平均表达了多少。
图 2：https：//www.lexogen.com/blog/classical-single-cell-rna-sequencing-a-comprehensive-overview/
单细胞测序到底是什么？
不给整块组织测 RNA，而是尽可能给每个细胞分别测 RNA。
例如：
Gene
Cell 1
Cell 2
Cell 3
EPCAM
8
0
0
CD3D
0
12
0
CD68
0
0
15
SPP1
0
0
21
这样一来，我们就可以发现：Cell 1 可能是上皮/肿瘤细胞；Cell 2 可能是 T 细胞；Cell 3 可能是巨噬细胞；而 SPP1 主要来自 Cell 3 这一类细胞。
如果一次测到 50000 个细胞，我们得到的就是一个包含数万个细胞 × 数万个基因的巨大表达矩阵。单细胞分析的本质，就是从这个矩阵里重新认识这块组织。
机器怎么知道哪条 RNA 来自哪个细胞？
目前常见的高通量单细胞 RNA 测序平台，会给来自不同细胞的 RNA 加上不同的细胞条形码（cell barcode）。例如：细胞 A → Barcode A。除此之外，通常还会给 RNA 分子加入唯一分子标识符（unique molecular identifier，UMI）。
Barcode 解决的是：「这是哪个细胞的 RNA？」
UMI 解决的是：「原来有多少个 RNA 分子？」
这两套标签组合起来，就能够把海量测序 reads 重新整理成：每个细胞 × 每个基因的表达矩阵。
因此，单细胞测序的流程为：组织获取，组织消化，制备单细胞悬液，单细胞捕获，RNA 逆转录并加入 Barcode 和 UMI，cDNA 扩增，文库构建，高通量测序，生成 Gene × Cell 表达矩阵，生物信息学分析。
图 3：https：//blog.csdn.net/Seraph09/article/details/118543748
为什么几万个细胞最后能变成几个「团」？
拿到单细胞数据，首先应该进行质量控制，之后就进入单细胞分析最经典的部分：降维和聚类。每个细胞原本都有成千上万个基因的表达信息。因此需要使用 PCA 等方法提取主要变化，再使用 UMAP 或 t-SNE 等方法把高维数据投影到二维空间。
于是我们就得到了单细胞论文中最常见的一类图：UMAP 图。
图 4：小编做图（一个点 ≈ 一个细胞）
表达模式相似的细胞，在低维空间中往往更加接近，于是形成一个个细胞簇。不同细胞具有相对特征性的基因表达模式。于是我们可以根据每个 cluster 的 marker genes，对细胞簇进行注释。
单细胞还可以二次聚类，定义新亚群。
例如把所有巨噬细胞单独提取出来，再进行二次聚类，可能发现：Macrophage 1，Macrophage 2。进一步分析 marker genes，可能看到：某群细胞 SPP1 高表达；某群细胞 C1QC 高表达；某群细胞表现出脂质代谢相关特征。
图 5：https：//alserglab.wustl.edu/mascarade/
FeaturePlot、Violin Plot、DotPlot 到底怎么看？
单细胞文章里经常出现几种经典图片。
1. FeaturePlot：这个基因主要在哪些细胞中表达？
例如把 CD3E 映射到 UMAP 上，如果某一群巨噬细胞区域明显高表达，就提示 CD3E 具有细胞亚群特异性。
图 6：https：//blog.csdn.net/qq_52813185/article/details/134673168
2、Violin Plot：某个基因在不同细胞群中的表达分布怎么样？
它比单纯看平均值多了一层信息：能够看到细胞之间的异质性。
图 7：https：//blog.csdn.net/qq_42090739/article/details/123250793
3、DotPlot：多个基因 × 多种细胞类型（适合做细胞注释和 marker 展示）
点的大小 → 表达该基因的细胞比例；
颜色深浅 → 平均表达水平。
图 8：https：//blog.csdn.net/qq_52813185/article/details/134647852
4、Heatmap：适合展示不同 cluster 的代表性差异基因。
如果每个 cluster 都能形成比较清晰、相对独立的 marker 表达模式，通常说明聚类具有一定生物学可解释性。
图 9：https：//zhuanlan.zhihu.com/p/598295530
怎么看一篇单细胞文章？
第一步：看样本：有多少患者？有哪些分组？每组几个生物学重复？
第二步：看质控：最终保留多少细胞？有没有明显批次效应？不同样本贡献是否严重失衡？
第三步：看细胞注释：作者根据什么 marker 定义这些细胞？
第四步：看核心细胞亚群：作者到底发现了哪一个特殊亚群？
第五步：看这个亚群为什么重要：它和疾病分期、治疗响应、预后或者其他临床特征有什么关系？
第六步：看机制：作者有没有从「相关性」继续推进到「因果关系」？
第七步：看实验验证：有没有组织、蛋白、细胞和动物层面的独立证据？
编辑：小 z
题图：图虫创意
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