低聚果糖（FOS）是一类天然存在于菊芋、菊苣和雪莲果等植物中的功能性低聚糖，通常由一到多个果糖分子末端连接一个葡萄糖组成，聚合度为2～10，被归类为可溶性膳食纤维和益生元。根据来源和糖苷键连接方式的不同，FOS可分为菊粉型（1F-FOS，果糖基之间由β(2→1)键连接，末端通过α(1→2)键连接D-吡喃葡萄糖）、Levan型（6F-FOS，果糖基之间由β(2→6)键连接，末端通过α(1→2)键连接D-吡喃葡萄糖）和新菊粉型（6G-FOS，含有两条β(2→1)键连接的果糖基链，分别通过α(1→2)键和β(2→6)键连接D-吡喃葡萄糖）等。其中菊粉型FOS生产工艺最为成熟，通常以蔗糖或菊粉为底物，分别经果糖基转移酶合成或菊粉酶水解生成。FOS应用广泛，具有多种有益人体健康的功效，如促进肠道有益菌群的增殖、提高免疫功能、调节脂质代谢和降低血糖血脂水平。2012年实施的GB 14880—2012《食品营养强化剂使用标准》中对婴幼儿配方食品、乳粉中FOS的添加量进行了明确规定。2022年实施的GB 1903.40—2022《食品营养强化剂 低聚果糖》对FOS的理化指标提出要求：依据GB/T 23528.2—2021《低聚糖质量要求 第2部分：低聚果糖》，采用FOS组分标准品对FOS进行定量检测，蔗糖来源的FOS原料质量分数应≥95%。此外，研究表明过量摄入FOS可能会加剧相关肠道疾病症状。因此，FOS的准确定量既是保障相关食品质量与安全的前提，也是提高功效研究准确性、推动精准营养发展的基础。有证标准物质是化学测量的“砝码”，是实现不同分析方法和实验室间量值溯源与一致性的关键，能为分析结果的准确性、可靠性与可比性提供保障。蔗果五糖是FOS的重要组分之一，针对以上现状，本研究开展了蔗果五糖纯度标准物质的研制工作。
标准物质研制主要涵盖主成分定性和纯度定值两个方面。与传统的有机小分子化合物相比，蔗果五糖在定性和定值方面的挑战主要体现在：1）FOS是一类结构复杂的碳水化合物，其分子因糖基组成的不同以及糖苷键连接位置的多样性，常存在多种异构体。以蔗果五糖为例，常见异构体包括果果五糖、异蔗果五糖、新蔗果五糖等，它们在糖基组成、糖苷键连接方式上存在细微差异，仅依靠质谱（MS）或传统的核磁共振（NMR）（一维氢核磁共振（1H NMR）、碳核磁共振（13C NMR）无法实现精细结构的确证；2）FOS缺乏发色团且无紫外吸收，因此无法使用紫外、荧光等检测器进行检测。目前，FOS检测常用的液相色谱-示差折光检测器或液相色谱-蒸发光散射检测器在标准物质纯度定值方面存在固有局限。基于此，中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所的齐琦、柳玉蓉、周霞*等人采用MS与NMR联用的策略，以实现蔗果五糖的精准定性表征。对于纯度定值，质量平衡（MB）法和定量核磁共振（qNMR）法是国际公认的有机化合物纯度定值方法，可实现向国际单位制的溯源。本研究采用MB和qNMR对蔗果五糖标准物质候选物进行纯度定值。MB法采用高效液相色谱-电雾式检测器（HPLC-CAD）实现对结构相关杂质的高灵敏度检测；qNMR法采用邻苯二甲酸氢钾为内标，通过比较蔗果五糖特征质子信号与内标特征质子信号的峰面积，确定分析物的绝对含量。取两种方法结果的平均值作为蔗果五糖标准物质的标准值。采用HPLC-CAD法对制备的标准物质进行均匀性和稳定性检验，并系统评估定值过程、均匀性及稳定性等因素所引入的不确定度，旨在为FOS相关检测提供溯源标准。
1 蔗果五糖标准物质候选物定性分析
1.1 MS定性分析
蔗果五糖的化学式为C30H52O26，平均分子质量828.72 Da，单同位素分子质量828.274 7 Da。蔗果五糖标准物质候选物的二级质谱图见图1，母离子[M-H]-的m/z 827.06与理论值一致。蔗果五糖在碰撞诱导解离模式下主要发生糖苷键断裂，m/z 647.08、485.07、323.09、178.97分别是母离子糖苷键断裂产生的B4/Z4、B3/Z3、B2/Z2、C1/Y1碎片，与文献中采用四极杆飞行时间MS获得的碎片离子相符。其中m/z 323.09和485.07为蔗果五糖的特征碎片离子，可用于区分其异构体，Kang Liping等通过比较蔗果五糖与其异构体的MS行为，证实这两个碎片离子为蔗果五糖所特有的标志性离子，为本研究定性分析提供可靠支撑。
1.2 NMR波谱定性解析
蔗果五糖结构式见图2。对蔗果五糖标准物质候选物的NMR谱图进行全面解析，由1H NMR谱可得到不同化学环境中氢的化学位移δ、耦合常数J和裂分模式（包含单峰s、双重峰d、三重峰t、多重峰m等）等信息（图3A）。其中，δ 5.42处的共振峰耦合常数为3.9 Hz，为典型的α葡萄糖端基质子（H1）特征。此外，可观察到与H3’、H4’（果糖基1）、H3”、H4”（果糖基2）及H3”’、H4”’（果糖基3）、H3””、H4””（果糖基4）对应的特征峰，分别位于δ 4.26（d，J＝8.7 Hz）、δ 4.03（t，J＝8.7 Hz）、δ 4.21（d，J＝8.7 Hz）、δ 4.06（t，J＝8.7 Hz）、δ 4.19（d，J＝8.7 Hz）、δ 4.09（t，J＝8.7 Hz）、δ 4.19（d，J＝8.7 Hz）和δ 4.09（t，J＝8.7 Hz）处。糖环上其余质子的化学位移位于δ 3.46～3.84范围内，由于信号重叠，需借助HSQC谱和1H-1H COSY谱等进一步归属。如图3B所示，蔗果五糖的13C NMR谱显示范围为δ 60～110。δ 93.10处的共振峰归属于葡萄糖单元的端基碳（C1）。如图3C所示，由于DEPT谱中季碳无信号，—CH碳显示正峰，—CH2碳显示负峰，结合13C NMR谱可确定果糖单元中C2’、C2”、C2”’和C2””分别在δ 103.63、δ 103.64、δ 103.85和δ 104.29处产生共振峰，糖环上除葡萄糖端基碳外，其余的—CH碳则在δ 69.82～81.84范围内被观察到。糖环上—CH2OH基团的碳信号位于δ 60.70～62.87之间。
为进一步解析1H谱中的重叠信号，采集了HSQC谱和1H-1H COSY谱，对1H NMR谱、13C NMR谱信号进行详细归属。HSQC谱可检测同碳氢之间的相互键联关系（1J（CH）），从而实现C—H直接相关性的明确归属。图4A HSQC谱中标注了所有交叉峰对应的C—H相关信号。1H-1H COSY谱反映氢原子3J（HH）和2J（HH）耦合关系，图4B谱图中对角线外的相关峰反映邻位氢之间的耦合作用（3J（HH））。例如，对于葡萄糖单元，可观察到H1与H2间的耦合信号（δ 5.42/3.52）、H2与H3间的耦合信号（δ 3.52/3.75）、H4与H5间的耦合信号（δ 3.46/3.82）。同样，也观察到了呋喃果糖环邻位氢之间的耦合信号，如H3与H4间的耦合（δ 4.26/4.03、δ 4.21/4.06、δ 4.19/4.09），H4与H5间的耦合（δ（4.03～4.09）/3.84）。综合上述分析得出蔗果五糖标准物质候选物所有碳和氢的完整归属表（表1）。
另外，本研究通过HMBC谱确定了糖苷键的位点，HMBC谱可检测碳氢远程相互键联关系（3J（CH））。从图4C可清晰观察到葡萄糖基H1（δ 5.42）与果糖基1的C2（δ 103.6）有强相关信号，果糖基1的H1（δ 3.83）与果糖基2的C2（δ 103.6）有强相关信号，果糖基2的H1（δ 3.71）与果糖基3的C2（δ 103.8）有强相关信号、果糖基3的H1（δ 3.80）与果糖基4的C2（δ 104.3）有强相关信号。这些HMBC相关信号证实了葡萄糖基与果糖基之间为α(1→2)糖苷键，果糖基之间为β(2→1)连接，与蔗果五糖结构相符。
2 蔗果五糖标准物质纯度定值
2.1 MB法定值结果
气相色谱和液相色谱结合高灵敏度检测器是结构相关杂质定量的常用手段。由于FOS缺少发色团，也无紫外吸收，多数不产生荧光，因此无法直接采用紫外检测器或者荧光检测器检测，主要使用示差折光检测器、蒸发光散射检测器和CAD等通用型检测器进行检测。其中，CAD灵敏度高，是结构非依赖型检测器，各化合物响应具有一致性，因此是结构相关杂质定值的首选。因此本研究选用HPLC-CAD对结构相关杂质进行定量。
本研究采用水/乙腈的流动相体系系统比较两种常用于糖类分析的色谱柱——Shodex NH2P-50 4E（250 mm×4.6 mm，5 μm）与Hypercarb（100 mm×4.6 mm，3 μm）对蔗果五糖及其杂质组分的分离性能。在使用Shodex NH2P-50 4E氨基柱时，即使采用优化的梯度洗脱条件（0 min，30% A、70% B；0～20 min，30～35% A、70%～65% B；20～20.1 min，35%～30% A、65%～70% B；20.1～30 min，30% A、70% B），其色谱图中主峰前仍出现一个未能完全分离的杂质峰，通过与标准品对比，确认为蔗果五糖的异构体——果果五糖（图5A）。鉴于氨基柱在异构体分离方面存在一定局限性，本研究进一步选用Hypercarb色谱柱进行分离优化，梯度洗脱条件如1.3.3.1节所述，色谱图见图5B。结果表明，在Hypercarb柱上果果五糖异构体与蔗果五糖主成分可实现完全分离，且峰形良好。最终选择Hypercarb柱对主成分和杂质进行分离，CAD作为检测器，使用校准曲线外标法进行杂质定量。
特别需要指出的是，CAD的线性范围较窄，因此采用HPLC-CAD技术分析标准物质候选物时，传统面积归一化法无法实现液相纯度的准确定量评估。在确保主成分与杂质达到基线分离的前提下，杂质定量优先采用对应杂质的纯度标准物质进行外标法定量；但对于低聚糖类化合物，目前可商业化获取的目标杂质纯度标准物质极为稀缺，限制了该方法的直接应用。鉴于CAD对结构相似化合物具有良好的响应一致性，可采用杂质的结构类似物纯度标准物质作为替代对照进行外标法定量。基于此，本研究中对蔗果五糖标准物质候选物中的结构相关杂质，均以蔗糖纯度标准物质为对照品，通过6 次平行测定的外标法完成定量分析。对蔗糖纯度标准物质的方法学验证结果显示，其基线噪声为0.02 pA，以3 倍信噪比（RSN＝3）设定检出限时，0.06 pA对应的最小上样量为2.5 ng。据此，将标准物质候选物配制成5 mg/mL的溶液，进样体积为5 μL，可确保样品中含量≥0.01%的杂质均能被有效检出。蔗果五糖标准物质的测定结果如下：果果五糖杂质质量分数为0.236%（相对标准偏差（RSD）4.8%），杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6和杂质7质量分数依次为0.037%（RSD 6.3%）、0.055%（RSD 3.2%）、0.107%（RSD 2.5%）、0.113%（RSD 2.29%）、0.070%（RSD 2.5%）和0.030%（RSD 5.3%）。综上，蔗果五糖标准物质候选物中结构相关杂质总量为0.648%，其中果果五糖是含量最高的杂质，其余杂质根据生产工艺推测为其他FOS组分。
采用1.3.3.2节所述方法分别对蔗果五糖标准物质中水分及无机元素进行定量，得到水分质量分数为3.58%（RSD 1.23%），无机杂质质量分数为0.003%（RSD 5.42%）。
对于挥发性杂质测量，称取10 mg蔗果五糖标准物质溶解于1 mL DMSO中，分别对标准物质溶液和DMSO空白进行平行分析。样品谱图见图6，与14 种常见挥发性组分混合标准溶液比对保留时间，发现样品中含有挥发性组分乙醇。采用乙醇标准物质配制系列标准工作溶液，外标法对标准物质中的乙醇杂质进行准确定量。乙醇杂质的质量分数为3.29%（RSD 2.02%）。
MB法定值结果使用Shapiro-Wilk检验法检验数据正态性，如表2所示，结果为W＝0.902 221 7，W(6,0.95)＝0.788，实测值大于临界值说明该数据在α＝0.05的水平上符合正态分布。同时使用Dixon准则进行可疑数据取舍，结果如下：f(0.05,6)＝0.628，数据由小到大排列为：92.43、92.46、92.48、92.50、92.50、92.51；r1＝0.374 976 2，rn＝0.125 023 8，r1＞rn且r1＜f(0.05,6)，该组数据中无可疑值。采用Grubbs准则进行异常值取舍，结果如下：λ(0.05,6)＝1.887 145，均值为92.48%，RSD为0.03%，该组数据中无异常值。综上，将上述杂质含量扣除后得到MB纯度定值结果为92.48%。
2.2 qNMR法定值结果
按照“相似相溶”的原理选择不同的氘代溶剂，氘代甲醇和氘水都是常见的大极性溶剂，与蔗果五糖的极性特征相近。通过对比溶解度发现，氘水能够同时溶解蔗果五糖和内标邻苯二甲酸氢钾，且不与二者发生化学反应，因此选择氘水作为定值的氘代溶剂。定量峰必须满足积分范围内无干扰，且基线平稳等条件，以减少误差。分别选择化学位移为δ 5.32与δ 7.46的共振峰作为蔗果五糖和邻苯二甲酸氢钾的定量峰（图7）。
在优化的条件下采用qNMR对随机抽取的6 个标准物质单元进行重复测定，结果见表3。qNMR定值结果采用Shapiro-Wilk检验法检验数据正态性，结果如下： W＝0.927 647 5，W(6,0.95)＝0.788，0.927 647 5＞0.788，表示该组数据符合正态分布。采用Dixon准则进行可疑数据取舍，结果如下：f(0.05,6)＝0.628，数据由小到大排列为：91.76、91.99、92.30、92.72、93.22、93.31；r1＝0.148 384 8，rn＝0.058 0623 3；因为r1＞rn且r1＜f(0.05,6)，该组数据中无可疑值。采用Grubbs准则进行异常值取舍，结果如下：λ(0.05,6)＝1.887 145，平均值为92.55%，RSD为0.69%，说明实验结果无异常值。可得到蔗果五糖标准物质qNMR测定的纯度为92.55%。
3 蔗果五糖纯度标准物质的定值结果
对蔗果五糖纯度标准物质的MB定值结果与qNMR定值结果分别使用Grubbs法与Dixon法进行异常值检验，未发现异常值。表4列出了两种方法定值结果及标准不确定度u，将uMB设为s1，uqNMR设为s2，采用t检验对两种测量方法结果平均值的显著性差异进行比较：根据自由度n1+n2-2＝10及显著性水平α＝0.05，查得临界值t0.05＝2.23。两种测量方法数据合并得到式（2）：
结果表明两种测量方法结果平均值不存在显著差异。根据JJF 1855—2020《纯度标准物质定值计量技术规范 有机物纯度标准物质》，t检验通过，取两种方法结果的平均值作为定值结果。因此蔗果五糖纯度标准物质纯度定值结果为（92.48%+92.55%）/2＝92.52%。
4 蔗果五糖纯度标准物质均匀性检验
根据JJF 1343—2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》，进行均匀性检验。从制备的200 瓶蔗果五糖纯度标准物质中，随机抽取11 瓶进行均匀性检验。本研究中采用HPLC-CAD法进行均匀性检验。并对测量结果进行单因素方差分析，计入标准物质总不确定度中。
由表5可知，蔗果五糖纯度标准物质33 次的纯度测量平均值为92.53%，F0.05(10,22)＝2.29，F＝0.40，F＜F0.05(10,22)，证明蔗果五糖纯度标准物质分装均匀，符合要求。不均匀性引入的不确定度ubb为0.015 1%。
5 蔗果五糖纯度标准物质稳定性检验
稳定性检验包括短期和长期稳定性检验（图8）。短期稳定性检验采用同步稳定性评估方案，模拟运输过程中极端高温天气环境下，是否能在短期内保持稳定状态。在50 ℃恒温烘箱中监测7 d，每个时间点取2 个单元进行纯度测定。长期稳定性检验采用经典稳定性评估方案，在室温干燥条件下保存，监测时间为12 个月，每次取2 个单元进行纯度测定。
采用线性回归模型对稳定性进行评估，计算斜率β1的标准偏差S(β1)，可用t检验法判断β1与0的显著差异，若tβ1大于t临界值，则表明斜率与0有显著差异，观察到不稳定性趋势；若tβ1小于该临界值，表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。本研究中，短期稳定性tβ1值为1.66，t分布临界值t0.95,3为3.18，tβ1＜t0.95,3，表明蔗果五糖纯度标准物质在50 ℃保存7 d稳定；长期稳定性tβ1值为0.51，t分布临界值t0.95,3为3.18，tβ1＜t0.95,3，表明蔗果五糖纯度标准物质在室温条件下保存12 个月稳定。
6 蔗果五糖纯度标准物质定值结果的不确定度评定
纯度标准物质定值结果的不确定度（uCRM）由3 部分组成，分别为定值过程带来的不确定度（uchar）、不均匀性引入的不确定度（ubb）、不稳定性引入的不确定度（长期稳定性ults和短期稳定性usts）。不确定度的合成公式如下：
根据式（3）对蔗果五糖纯度标准物质的不确定度进行计算，结果见表6。蔗果五糖纯度标准物质的扩展不确定度为0.50%（ k ＝2）。
7 结论
本研究成功研制了蔗果五糖纯度标准物质，并系统阐述了其全面表征与定量分析方法。作为国内首次获批的FOS类纯度标准物质（编号：GBW（E）100994），其标准值为92.52%，扩展不确定度为0.50%（k＝2），为FOS相关检测提供了可靠的溯源依据。针对蔗果五糖存在的糖基组成差异及糖苷键连接位置异构体等特点，本研究采用二维NMR技术进行了全面结构解析与表征。同时，利用MS对其二级谱图进行了分析，确保了结构鉴定的准确性。在杂质定量方面，本研究针对糖类化合物缺乏紫外吸收或发色基团的特性，创新性地采用高灵敏度CAD并结合Hypercarb色谱柱实现了高纯原料中微量异构体杂质的分离与定量，检出限低至0.01%以下。研制的纯度标准物质表现出优异的均匀性和稳定性：在运输条件下及12 个月内的储存期内，其特性量值保持稳定，确保了纯度标准物质在实际使用中的可靠性。本研究建立的高准确度计量方法体系也可为其他低聚糖类化合物纯度标准物质的研发提供重要参考。
作者简介
通信作者：
周霞，博士，中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所副研究员。国家一级注册计量师，长期致力于食品营养与安全计量领域研究。现任北京理化分析测试技术学会理事、《化学试剂》期刊青年编委。主要研究方向为低聚糖等营养功效成分结构表征与标准物质研制、液相色谱质谱精准检测技术开发。
主持国家市场监督管理总局科技计划项目1 项，作为任务负责人参与多项国家重点研发计划、国家乳业技术创新中心攻关课题。近五年以第一/通信作者发表论文10余篇，多篇成果发表于Food Chemistry、Food Control、LWT-Food Science and Technology、Talanta等国际知名期刊；授权发明专利2 项，参与起草2 项国家食品补充检验方法。成功研制低聚果糖、甜菊糖苷等国家标准物质6 项，作为共同完成人获中国计量测试学会进步一等奖、二等奖各1 项。
第一作者：
齐琦，硕士研究生，哈尔滨医科大学药物分析专业，2025年前往中国计量科学研究院研修，主要从事低聚糖类标准物质研制及异构体精准结构表征研究。
引文格式：
齐琦, 柳玉蓉, 李秀琴, 等. 蔗果五糖精准定性表征与纯度标准物质研制[J]. 食品科学, 2026, 47(11): 321-330. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250916-130.
QI Qi, LIU Yurong, LI Xiuqin, et al. Accurate qualitative characterization of 1F-β-fructofuranosyl nystose and development of its purity reference material[J]. Food Science, 2026, 47(11): 321-330. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250916-130.
实习编辑：安宏琳；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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