01研究背景
肝纤维化是慢性肝病进展为肝硬化及肝细胞癌的核心病理环节，全球约8.44亿人罹患慢性肝病，每年导致约200万人死亡。尽管抗病毒治疗在慢性乙型肝炎和丙型肝炎领域取得显著进展，但针对已形成的肝纤维化，目前仍缺乏能够有效逆转纤维化灶的获批药物。代谢功能障碍相关脂肪性肝病已成为全球第一大慢性肝病，成人患病率约38%，预计至2040年将超过55%，其中相当比例患者将经历纤维化进展，部分进展为肝硬化和肝细胞癌。更为关键的是，纤维化在不同患者中的转归存在显著异质性——部分患者可自发出现纤维化消退，另一些患者则持续恶化，其细胞和分子机制长期不明。
本研究是一项基于单细胞固定RNA测序（FLEX）的机制探索性研究，旨在利用该技术绘制肝纤维化进展与消退的高分辨率细胞图谱，并鉴定新型抗纤维化治疗靶点。研究采用硫代乙酰胺（TAA）诱导的小鼠肝纤维化模型，将实验动物分为三组：健康对照组（n=3）、TAA腹腔注射10周的纤维化组（n=3）以及停药2周的纤维化消退组（n=3），每组3个生物学重复。肝脏组织经4%多聚甲醛固定、酶解消化后，采用10x Genomics Chromium FLEX平台进行单细胞RNA测序，共获得38,136个高质量单细胞（对照组13,948个、纤维化组14,986个、消退组9,202个）。分子验证手段涵盖免疫印迹法、免疫组织化学、流式细胞术、基因沉默/过表达、细胞因子/磷酸激酶芯片阵列，以及MASLD（n=34）和HCV（n=76）患者队列的肝活检标本分析。
03研究结果
▌全细胞图谱揭示纤维化消退的多维重塑FLEX分析将38,136个细胞注释为10种主要细胞类型。纤维化肝脏中巨噬细胞、免疫细胞、胆管细胞和肝星状细胞比例升高，肝细胞和肝窦内皮细胞比例下降，消退期部分逆转。
研究鉴定出恢复性肝细胞亚群，定位于肝小叶中央静脉周围，高表达代谢和抗氧化基因。该亚群与消退期肝星状细胞共同表达视黄酸应答蛋白2，该分子在健康肝脏中高表达，纤维化期下降，消退期恢复，具有抗纤维化功能活性。肝窦内皮细胞在消退期CD146阳性比例从纤维化期13.0%恢复至25.8%，窗孔结构重建，上调细胞外基质降解基因。基质金属蛋白酶7为纤维化期胆管细胞最显著上调基因，血清水平约200 pg/ml（P＜0.0001），消退期回落。
▌轴突导向因子4D驱动肝纤维化巨噬细胞分析鉴定出12个亚群。轴突导向因子4D被鉴定为KC2和单核来源巨噬细胞的特异性分泌因子，表达水平显著高于KC1（定量PCR约12-18倍，P＜0.01；免疫印迹约1.5-1.8倍，P＜0.0001）。血清水平纤维化期约30 pg/ml（P＜0.05），免疫组化阳性面积约1.0%（P＜0.05）。配体-受体分析揭示其与Plexin B2构成巨噬细胞-肝星状细胞核心通讯通路，纤维化期激活，消退期消失。
治疗学验证：VX15/2503以5 mg/kg、每周两次、持续5周，天狼星红阳性面积从约15%降至约5%（P＜0.01），细胞角蛋白19阳性面积从约2.0%降至约0.8%（P＜0.0001），肝星状细胞活化标志物、巨噬细胞浸润标志物及肝细胞增殖标志物均减少，血清转氨酶无显著变化。
▌LIM及半胱氨酸富集结构域蛋白1维持肝星状细胞活化肝星状细胞分析鉴定出9个亚群。LIM及半胱氨酸富集结构域蛋白1为纤维化期特异性高表达的转录共调节因子，原代小鼠肝星状细胞中分离后第4-7天显著上调（mRNA约3-5倍，蛋白约2-3倍）。小干扰RNA沉默（效率95%）显著抑制I型胶原α1链（约60%↓）、平滑肌肌动蛋白α2（约65%↓）等；过表达则促进上述基因表达（约15-20倍↑）。
机制上，该蛋白通过蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路驱动活化。过表达增强蛋白激酶B Ser473磷酸化，诱导PRAS40 Thr246和4EBP1 Ser65磷酸化。抑制剂AZD8055（1 μM）有效逆转促纤维化效应，下调16/37个磷酸化蛋白，在三种激活模型中均呈剂量依赖性抑制。
▌人体验证与肝细胞癌风险预测代谢功能障碍相关脂肪性肝病队列（n=34）和丙型肝炎病毒队列（n=76）显示，两靶点与纤维化分期显著正相关。轴突导向因子4D在丙型肝炎病毒队列中从F1期约1%递增至F4期约15%（P＜0.0001）；LIM及半胱氨酸富集结构域蛋白1从F1期约1%递增至F4期约35%（P＜0.0001）。
持续病毒学应答后肝细胞癌风险预测：18例未发生肝细胞癌者应答后两靶点显著下降；6例发生肝细胞癌者持续高水平。LIM及半胱氨酸富集结构域蛋白1在未发生组从约15%降至约2%（P＜0.05），肝细胞癌组维持约20%（P＜0.0001）；轴突导向因子4D在未发生组从约1.5%降至约0.2%（P＜0.05），肝细胞癌组从约0.5%升至约1.0%（P＜0.05，图1）。
▌纤维化消退期的免疫微环境重塑消退期NK/T细胞中初始T细胞样亚群和CD8+记忆T细胞样亚群富集，上调T细胞激活和抗原受体信号通路；B细胞上调B细胞受体信号；中性粒细胞激活Toll样受体和活性氧代谢通路。提示纤维化消退涉及先天性和适应性免疫协同重塑。
04总结
本研究首次将单细胞固定RNA分析技术应用于肝纤维化领域，构建了涵盖纤维化进展与消退全过程的高分辨率细胞图谱，从中鉴定出两个具有高度转化价值的治疗靶点——轴突导向因子4D和LIM及半胱氨酸富集结构域蛋白1。前者由KC2和单核来源巨噬细胞特异性分泌，通过配体-受体信号轴激活肝星状细胞，人源化单克隆抗体VX15/2503在动物模型中显著减轻纤维化负荷；后者为肝星状细胞内源性转录调控因子，通过蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路维持细胞持续活化，其沉默可显著抑制纤维化基因表达。两靶点在代谢功能障碍相关脂肪性肝病和丙型肝炎病毒患者队列中的表达均与纤维化分期呈显著正相关，且在持续病毒学应答后持续高表达与肝细胞癌发生风险密切相关。该研究突破了既往单细胞研究仅聚焦纤维化进展的局限，首次同时覆盖进展与消退的双向动态，揭示了“双靶点、双机制、双细胞类型”协同驱动纤维化的分子网络，为开发联合抗纤维化治疗策略提供了明确的理论依据和完整的证据链。
参考文献DUC P M, THUY L T T, HAI H, et al. Single-cell fixed RNA profiling uncovers SEMA4D and LMCD1 as therapeutic targets in a liver fibrosis model[J]. JHEP Rep, 2026; 8(5): 101783. DOI: 10.1016/j.jhepr.2026.101783.
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