2026年3月31日，北京中医药大学李晓骄阳教授以独立通讯在Targetome (Targetome是中国药科大学的官方期刊，该期刊致力于聚焦开创性研究，旨在发现具有转化潜力的新型治疗靶点，推动药物研发创新，并促进精准医学的发展。)在线发表题为“Acteoside mitigates hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting CMPK2-intervened redox metabolism”（毛蕊花糖苷通过靶向 CMPK2 介导的氧化还原代谢来减轻肝脏缺血再灌注损伤）的研究论文。
【通讯作者】李晓骄阳，北京中医药大学教授、博导、博士后合作导师、美国弗吉尼亚联邦大学博士后及高级访问学者，现任北京中医药大学科研处副处长兼任期刊中心副主任。 获得国家高层次人才特殊支持计划、青年岐黄学者、全球前2%顶尖科学家、北京市科技新星、中华中医药学会青年科技创新奖获得者、中华中医药学会青年人才托举工程（A类）获得者、北京中医药大学人才A岗及壶天青年学者。现为国家中医药管理局高水平中医药重点学科中医疫病学学科方向带头人、国家中医药传承创新团队、北京中医药薪火传承“新3+3”工程赵绍琴“三名”传承工作室重点培养人才。兼任中华中医药学会感染病分会副秘书长、中华中医药学会肝胆病分会青年副主任委员、中华中医药学会青年委员会委员等。
研究方向：中医药防治慢性肝病（肝纤维化、非酒精性脂肪肝、肝癌等）功效机理解析
主要成果：主持10余项国家及省部级题，以通讯或第一作者在Journal of Hepatology、Science Bulletin、Hepatology、Theranostics、APSB等知名期刊发表论文90余篇（IF＞10分25篇），他引3800余次（2篇ESI高被引，3次获Editorial Comments，3次获封面文章）。依托相关成果入选国际F1000Prime库、梅斯医学中国十大医学研究、中国精品科技期刊顶尖学术论文F5000、国际中医药与传统医药高影响力研究、美国肝病协会组委会研究奖及青年科学研究学者奖。授权专利19项、软著3项、团标3项，获得教育部科学研究优秀成果奖二等奖、省科学技术进步一等奖2次及中华中医药学会青年科技创新奖等。作为指导教师指导学生入选中国科协首届青年人才托举工程博士生专项计划、北京中医药大学“壶天博士后计划”，获国家自然科学基金博士后面上项目、国家资助博士后研究人员计划和国家自然科学基金青年项目、10人次研究生国家奖学金。
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【摘 要】
肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）是肝脏手术和肝移植后不可避免的并发症。胞嘧啶单磷酸激酶2（CMPK2）在调控线粒体DNA（mtDNA）合成和氧化还原代谢中发挥着至关重要的作用，但其在HIRI中的作用及其潜在治疗手段仍不明确。我们通过整合测序技术和多种分子生物学实验证实，在HIRI的起始阶段，过量的酰基辅酶A（Acly-CoA）促进了酰基辅酶A硫酯酶2依赖的线粒体游离脂肪酸的合成和积累，从而促进了肝细胞中活性氧（ROS）的产生。在氧化应激反应中，CMPK2刺激mtDNA的合成和氧化，mtDNA进一步通过开放的线粒体通透性转换孔（mPTP）释放，并以自分泌的方式激活TLR9-MYD88-NF- κB -IRF1信号通路。我们随后证实，毛蕊花苷（ACT）在体内外均能显著保护CMPK2介导的氧化还原代谢，并能缓解缺血再灌注损伤（HIRI）。机制上，ACT抑制IRF1核转位，从而抑制Cmpk2和Duox2的转录，防止活性氧（ROS）的产生和线粒体DNA（mtDNA）的泄漏。此外，ACT还能结合CMPK2并促进其线粒体自噬依赖性的降解。值得注意的是，在肝细胞中特异性过表达CMPK2可阻断ACT的治疗作用。综上所述，我们的研究结果表明CMPK2是HIRI中氧化还原失调的关键驱动因素，并强调ACT作为一种多靶点治疗药物具有临床转化潜力。
01
研究背景及科学问题
肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）是一种重要的病理生理过程，其特征是过度氧化应激、代谢失衡和炎症，发生在肝脏经历氧气和营养供应不足一段时间后，随后血流恢复时[ 1 ]。它是多种临床情况下不可避免的并发症，例如肝切除或肝移植，并可能导致严重的后果，包括围手术期全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭[ 2 ]。HIRI的发病机制通常包括两个阶段。在初始缺血阶段，血流受限会诱发细胞代谢紊乱，导致活性氧（ROS）过度生成、线粒体膜电位（MMP）崩溃和肝毒性[ 3 ]。血液再灌注会通过诱导内源性损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，例如高迁移率族蛋白B1（HMGB1）或线粒体DNA（mtDNA），进而激活Toll样受体（TLRs） ，从而进一步加剧氧化应激和炎症[ 4 ]。目前避免或减轻缺血再灌注损伤（HIRI）的临床策略主要集中于缩短缺血时间、采用缺血预适应或及时使用药物干预。然而，现有的抗氧化剂和线粒体保护剂对HIRI的保护作用有限，这构成了一个亟待解决的重大临床挑战。
线粒体及其相关的代谢过程同时影响着氧化应激、代谢紊乱和炎症反应之间的复杂相互作用。我们最近发现，肝缺血再灌注损伤（HIRI）会引发三磷酸腺苷（ATP）合成的破坏、活性氧（ROS）的爆发性积累以及线粒体动力学失衡，最终导致肝细胞能量危机[ 5 ]。既往研究强调，在缺血期，线粒体功能障碍与脂质代谢紊乱相关，且发生在HIRI的炎症事件和细胞死亡之前[ 6 ] 。有趣的是，游离脂肪酸（FFA）诱导的脂质沉积也会刺激肝细胞中ROS的爆发和氧化应激，并对线粒体功能产生反向影响[ 7 ]。此外，脂质-活性氧（ROS）积累和线粒体功能障碍协同加速线粒体DNA （mtDNA）的氧化和释放[ 8 , 9 ] ，进一步形成以脂质代谢紊乱、线粒体氧化还原功能障碍和炎症加剧为特征的恶性循环[ 10 , 11 ] 。因此，识别同时影响线粒体脂质代谢和以mtDNA为中心的氧化应激的关键通路，可能直接减轻与缺血再灌注损伤（HIRI）相关的损害。胞嘧啶单磷酸激酶2（CMPK2）主要定位于线粒体，是合成脱氧核苷三磷酸以调节mtDNA复制的限速酶[ 12 ]。据报道，敲低CMPK2可以减少mtDNA释放到胞质溶胶中[ 13 ]。最近有报道称，CMPK2在代谢性肝病患者的肝脏中显著上调。此外，肝细胞特异性敲除Cmpk2可显著抑制炎症和随后的肝细胞焦亡[ 14 ]，但其在肝缺血再灌注损伤（HIRI）发展中的确切功能仍不明确。
许多天然产物因其广泛的生物活性、较高的安全性以及长期使用副作用极小而备受关注，有望为肝损伤相关炎症（HIRI）的治疗带来新的希望。临床前研究表明，白藜芦醇、人参皂苷、姜黄素、丹酚酸以及三七总皂苷均具有抗氧化和抗炎作用，并能调节HIRI中的代谢紊乱，无论单独使用还是与其他药物联合使用[ 15 , 16 ] 。毛蕊花苷（ACT）是一种广泛存在于肉苁蓉和地黄等传统中药中的苯丙素苷，因其对多种肝脏疾病的抗氧化、抗炎和抗凋亡特性而日益受到关注。我们之前的研究表明，ACT抑制了受损肝细胞来源的DAMPs的合成和向肝窦内皮细胞（LSECs）的转移，从而逆转了LSEC的衰老并改善了HIRI中的肝窦微环境[ 4 ]。此外，我们最近证实，ACT增强了poly(RC)结合蛋白2 (PCBP2)-系统Xc−的结合亲和力，从而通过限制缺氧诱导因子1α (HIF-1α)和p300，限制了HIRI期间HMGB1诱导的肝细胞铁死亡、M1巨噬细胞募集和免疫反应[ 17 ]。尽管已初步观察到 ACT 与肝细胞保护作用之间的关联，但仍需进一步证实 CMPK2 在脂质代谢异常、氧化应激和 HIRI 发展中的确切功能，以及阐明 ACT 的具体作用方式。
本研究综合运用体内HIRI小鼠模型、体内肝细胞特异性Cmpk2过表达模型和体外缺氧复氧（HR）模型，结合全肝及单细胞RNA测序（RNA-Seq）和一系列分子生物学实验，深入探究了ACT如何通过调控TLR9-干扰素调节因子1（IRF1）-CMPK2/双氧化酶2（DUOX2）-线粒体DNA轴，改善氧化还原代谢，并阻断HIRI中以CMPK2为中心的脂毒性-高氧化-炎症恶性循环。本研究不仅为CMPK2在HIRI过程中线粒体脂质代谢与氧化还原失调相互作用中的病理作用提供了新的见解，而且有助于ACT从实验室走向临床应用，成为预防HIRI的一种极具前景的新策略。
02
重要发现及亮点
ACT的抗HIRI作用与肝脏线粒体氧化还原代谢的调节密切相关
我们初步表明，ACT可通过修复以PCBP2为中心的肝细胞铁死亡和减轻肝窦内皮细胞（LSEC）衰老来改善肝缺血再灌注损伤（HIRI），而这两者都与细胞代谢紊乱和氧化还原反应密切相关[ 4 , 17 ]。在此，我们进行了动物实验，以进一步研究ACT对肝脏线粒体脂质代谢和氧化死亡模式的影响。如图S1a所示，与血清转氨酶升高相一致，HIRI显著增加了炎症浸润、肝窦充血、水肿和以肝细胞为中心的细胞凋亡，这由TUNEL试剂和肝细胞核因子4α（HNF-4α）的共染色面积增加所证实（图1a和b；图S1b - S1d）。值得注意的是，ACT显著逆转了肝脏中与缺血性损伤和肝细胞死亡相关的病理现象。接下来，我们对不同组别的肝脏以及从肝组织中分离的单细胞类型肝细胞进行了RNA测序分析。利用这些不同的测序数据进行比较和相关性分析，从而筛选出核心靶点簇。如图1c所示，HIRI组全肝中主要改变的功能注释涉及ATP合成偶联的电子传递、细胞凋亡过程和炎症反应，而ACT显著逆转了这些过程。有趣的是，我们还观察到，酰基辅酶A（Acyl-CoA）代谢过程、DNA代谢过程、脂质代谢过程以及线粒体细胞色素c的释放和线粒体电子传递等类似的生物学过程在HIRI组中发生了显著改变，但在ACT治疗组中未发生改变（图1d）。在对全肝和细胞水平的数据集进行比较和分析后，我们发现共同的关键靶点主要是Cmpk2和髓系分化原初反应蛋白88 ( Myd88 )（图1c和d）。此外，我们进行了图1e的分析，并重点介绍了ACT逆转HIRI的关键过程，这些过程涉及内质网相关蛋白降解途径、细胞凋亡执行阶段、脂肪酸氧化和氧化磷酸化。此外，通过对体内和体外水平的RNA-seq数据进行交叉分析，我们鉴定了主要包括线粒体、脂质代谢过程和细胞凋亡过程在内的最关键通路（图1f） 。最后，我们对肝组织和肝细胞进行了脂肪细胞分化相关蛋白（ADRP）染色，进一步阐明了ACT主要通过重新平衡线粒体中的脂质积累和氧化还原事件来干预脂质代谢过程（补充图S2a和S2b）。
图1. ACT减轻了HIRI小鼠和HR刺激的肝细胞的肝损伤。(a) 不同组别的H&E染色代表性图像（箭头指示肝损伤区域，包括炎症灶）。比例尺 = 100 μm。(b) 不同组别的HNF-4α和TUNEL免疫组化染色代表性图像。比例尺 = 100 μm。(c) 和 (d) 分别为不同组别小鼠分离的全肝和原代肝细胞中关键差异表达基因（DEGs）的热图，红色线条指示不同的基因簇。(e) 小鼠肝脏（上图）和原代肝细胞（下图）中HIRI组和HIRI+ACT组的基因集富集分析（GSEA）。(f) 以气泡图形式可视化的全肝和原代肝细胞差异表达基因的GO富集分析结果。
ACT影响由ACOT2控制的脂肪酸合成，并重塑线粒体氧化代谢
随后，我们对原代肝细胞的RNA-seq数据进行了热图分析，重点关注参与脂质合成、转运和代谢的基因，特别是酰基辅酶A硫酯酶（ACOTs）家族的基因。图2a展示了差异表达基因（DEGs）的层级聚类结果。在HIRI组中，我们检测到Acot2显著上调，Acot2是肝细胞中负责将酰基辅酶A水解为游离脂肪酸（FFA）的靶基因，而其他ACOTs家族成员则未见上调。与此一致的是，HIRI小鼠肝脏中ACOT2的表达及其与线粒体标志物线粒体外膜20（TOM20）的共定位均增加，但在ACT治疗后则逆转（图2b；补充图S3a）。 AML12细胞中ACOT2的翻译变化趋势与小鼠肝脏中的变化趋势相同（补充图S3b）。由于ACOT2的强烈干预，HIRI手术后肝脏FFA含量显著增加（图2c ，上图），更重要的是，其与小鼠肝脏中Acot2 mRNA表达的变化呈正相关（图2d，上图）。同时，ACT逆转了HIRI手术引起的FFA积累，并打破了其与Acot2的正相关性。进一步分析显示，在HR损伤和ACT给药下，肝细胞中FFA含量及其与Acot2 mRNA的相关性均呈现相似的趋势（图2c和d，下图）。此外，FFA的积累通常会通过多种途径导致线粒体ROS的过度产生。如图2e和f所示；补充图S3c显示，ACT减轻了HR诱导的ROS积累和氧化应激，其特征是DCFH-DA荧光面积和丙二醛（MDA）水平（脂质过氧化的典型标志物）降低，谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）水平（抗氧化能力的公认指标）升高。氧化反应对于维持线粒体稳态至关重要，它通过防止脂质沉积和促进呼吸作用产生能量来维持线粒体稳态。图2g展示了与脂肪酸合成相关的FFA生物过程基因，例如酰基辅酶A合成酶长链家族成员1（Acsl1）、脂肪酸转运和氧化相关基因，如肉碱棕榈酰转移酶1a（Cpt1a）和酰基辅酶A氧化酶1（Acox1）。值得注意的是，与β相关的基因发生了变化。β-氧化尤其显著。与此一致的是，HIRI或HR诱导的线粒体中FA β-氧化相关基因的mRNA表达下调，在ACT给药后显著恢复（图2h）。此外，ACT处理的AML12细胞表现出比HR组更优的线粒体功能，表现为ATP水平升高以及线粒体复合物I和IV活性增强（图2i）。这些结果表明，ACT通过降低ACOT2的表达来减少FFA的过度生成，并选择性地重新激活ACOX1以恢复氧化代谢，从而重塑线粒体的氧化还原平衡。
图2. ACT抑制ACOT2表达，进而导致线粒体氧化代谢紊乱。(a) 原代肝细胞中线粒体代谢相关基因的热图。(b) 小鼠肝脏中TOM20 (594 nm)、ACOT2 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺 = 100 μm。(c) 小鼠肝脏和AML12细胞中游离脂肪酸(FFA)水平。(d) 小鼠肝脏和AML12细胞中FFA水平与Acot2基因表达的相关性分析。(e) AML12细胞中活性氧(ROS) (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺 = 20 μm。(f) 小鼠肝脏中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)水平。(g) 原代肝细胞中脂肪酸β-氧化和酰基辅酶A代谢相关基因的热图。在小鼠肝脏和经ACT处理的AML12细胞中， Cpt1a、 Acox1和Acsl1的mRNA水平以Hprt1进行标准化。(i) AML12细胞中ATP水平以及线粒体复合物I和IV的活性。统计学意义：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，与对照组相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，与模型组相比（数据以平均值±标准误表示，细胞实验n = 3，小鼠实验 n = 6）。
ACT通过抑制CMPK2来阻止肝细胞中mtDNA的产生和释放
氧化应激不仅会引发线粒体功能障碍，还会刺激损伤相关分子模式（DAMPs）的持续释放。我们进行了环状网络图分析，发现绝大多数差异表达基因（DEGs）都与核酸相关，包括Tlr9、Cmpk2和Irf1，它们主要影响HIRI组和HIRI+ACT组肝细胞中线粒体DNA（mtDNA）的识别、合成和调控（图3a）。接下来，我们重点研究了mtDNA相关的氧化应激和线粒体功能的变化。差异表达基因的火山图显示，参与活性氧（ROS）和mtDNA产生及响应的基因，包括Cmpk2、Tlr2、Tlr9和Cxcl10，在HR损伤下显著上调，但在ACT治疗后则下调（图3b）。在这些共同反映线粒体DNA（mtDNA）轴关键步骤的基因中，Cmpk2表现出最显著且一致的 ACT 逆转变化。在高活性氧（ROS）条件下，由于缺乏组蛋白保护且靠近氧化呼吸链，mtDNA 特别容易受到氧化损伤。这种脆弱性导致氧化型 mtDNA （ox-mtDNA）的产生增加[ 18 ]。随后，通过 TOM20 与抗 DNA 或 8-OHdG 的共染色来可视化 mtDNA 和 ox-mtDNA 的含量。如图3c和补充图 S4a和S4b所示，与同源重组（HR）刺激相比，ACT 显著降低了 mtDNA 和 ox-mtDNA 的含量。值得注意的是，在图 3b中参与 mtDNA 相关生物学过程的各种差异表达基因（DEGs）中，我们发现Cmpk2与 mtDNA 合成的关联最为密切。有趣的是，在HIRI或HR损伤后，全肝细胞和分离的线粒体中CMPK2蛋白水平显著升高，而ACT干预可显著降低其水平，尤其是在线粒体组分中（图3d和e）。线粒体通透性转换孔（mPTP）过度开放，是由电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）介导的，会导致线粒体肿胀、嵴破坏，最终导致膜破裂。本研究采用mPTP抑制剂环孢素A（CsA）、mPTP开放激活剂（包括羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP，促进MMP去极化）和ATP（刺激VDAC寡聚化））来检测mPTP的开放状态[ 19 ]。ACT抑制了VDAC1介导的mtDNA释放和mPTP的异常开放，表现为抗DNA抗体与VDAC1共定位的下调，以及Calcein荧光强度的恢复（图3f和g；补充图S4c）。同样，我们发现，在HIRI或HR损伤后，ACT显著降低了血清和条件培养基中mtDNA的含量和释放量（图3；补充图S4d ）。如图3i和补充图S4e所示，JC-1和TMRE染色结果表明，在HR处理的肝细胞中观察到了由MMP异常引起的肝细胞死亡，而在ACT处理的肝细胞中未观察到。
图3. ACT通过抑制CMPK2抑制缺氧肝细胞中mtDNA的合成和释放。(a) DAMP分子环状网络图。(b) HIRI组和HIRI+ACT组原代肝细胞中差异表达基因(DEG)表达的火山图。(c) AML12细胞中TOM20 (594 nm)、抗DNA (488 nm)、8-OHdG (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺=20 μm。(d)、(e) 小鼠肝脏和AML12细胞中全细胞和线粒体中CMPK2的蛋白表达水平以β-肌动蛋白或TOM20进行标准化。(f) AML12细胞中VDAC1 (594 nm)、抗DNA (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺 = 20 μm。(g) AML12 细胞中 Calcein AM (488 nm) 免疫荧光染色的代表性图像。比例尺 = 20 μm。(h) 左图：小鼠血清中 mtDNA 水平；右图：AML12 细胞培养基中 mtDNA 水平。(i) AML12 细胞中 JC-1 分析的流式细胞术结果。统计学意义：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，与对照组相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，与模型组相比（数据以平均值 ± 标准误表示，细胞实验n = 3，小鼠实验 n = 6）。
缺氧通过TLR9-MYD88-NF -κB信号通路 触发IRF1的激活和核转位，而ACT可完全阻断这一过程
基于肝细胞特异性RNA测序数据分析主要反应受体谱后，我们预测，HR刺激后， TLR2等多种TLR表达显著升高，而ACT干预后则降低。尽管HR组中TLR9和TLR7的表达水平并不高，但在ACT给药后观察到其表达显著降低，尤其是TLR9基因的P值更高（图4a）。值得注意的是，TLR9主要在内体中表达，并因其对细胞内和细胞外来源的mtDNA的反应而闻名[ 20 ]。虽然目前尚无文献表明TLR2可以直接响应mtDNA，但它可能感知由mtDNA触发的其他DAMPs [ 21 , 22 ]。 qPCR分析和多重免疫荧光染色均观察到一致的结果，表明在HIRI小鼠肝脏和经HR处理的肝细胞（以肝细胞标志物HNF-4α或CK18标记）中TLR2和TLR9表达上调；然而，给予ACT后，TLR2和TLR9表达下调（图4b和c；补充图S5a - S5c ）。如图4d和补充图S6a所示，CsA引起的mPTP关闭显著降低了TLR2和TLR9的相对荧光强度，即使在HR条件下也是如此；而FCCP和ATP诱导的mPTP持续开放刺激了这两种受体的表达，但ACT不再逆转这种作用。除TLR3外，所有TLR均通过MyD88通路传递信号，并激活核因子-κB (NF- κB )转录因子，从而加剧肝脏炎症[ 23 ]。HIRI组和HR组中TLR9、MyD88和p-NF-κB p65的蛋白水平均显著升高，而ACT治疗可降低这些蛋白水平（图4e；补充图S6b ）。ACT对体外TLR2表达的降低作用不显著。接下来，为了进一步确定哪些转录因子或下游基因受到NF- κB的影响，我们利用CHEA3数据库进行预测，最终发现了IRF1（图4f）。最近有报道称，NF- κB p65可与Irf1启动子区域结合，从而激活其转录。[ 24 ]进一步转位至细胞核内，并作为转录因子激活下游基因网络。如图4g和补充图S6c所示，与HR组相比，ACT显著下调了IRF1的荧光表达和核定位。然而，在mPTP持续激活的情况下，这种ACT介导的限制性转位效应被完全抑制（图4h；补充图S6d）。
图4. ACT通过调控TLR9-MYD88-NF- κB信号通路抑制IRF1的核转位。(a) 原代肝细胞中TLR基因表达的三维图。(b) 小鼠肝脏和(c) AML12细胞中TLR9 (647 nm)、TLR2 (594 nm)、HNF-4α (488 nm)、CK18 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺分别为100 μm和20 μm。(d) AML12细胞中TLR9 (647 nm)、TLR2 (594 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺为20 μm。小鼠肝脏和AML12细胞中TLR9、TLR2、MYD88、p-NF-κB p65和NF-κB p65的蛋白表达水平以β-肌动蛋白进行标准化。(f) 筛选调控CMPK2基因的转录因子。(g)、(h) AML12细胞中IRF1 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺 = 20 μm。统计学意义：*** P < 0.001，与对照组相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，与模型组相比（数据以平均值±标准误表示，细胞实验n = 3，小鼠实验 n = 6）。
ACT通过抑制IRF1来减少CMPK2的转录以及随后的mtDNA合成和释放
为了进一步验证ACT是否通过抑制IRF1核转位来影响线粒体损伤相关分子模式（mito-DAMPs）相关靶点的激活，我们将HIRI+ACT组与HIRI组（黄色阴影区域）的差异表达基因（DEGs）与ENCODE（绿色阴影区域）、GTRD（蓝色阴影区域）和CHIP_Atlas（粉色阴影区域）数据库中与IRF1下游靶点相关的基因信息整合在一起（图5a）。我们重点关注四个基因集中191个基因的交集，这些基因集主要涵盖线粒体DNA复制、细胞氧化还原稳态和炎症反应等领域。此外，我们还对这191个差异表达基因中的关键基因进行了反向预测分析，结果表明IRF1是主要的潜在转录因子（图5b）。结合上述两种预测方法，我们筛选出表达倍数变化显著的基因进行进一步研究，包括Cmpk2、Hmgb1和Duox2。在HIRI和HR组中，Cmpk2、Hmgb1和Duox2的mRNA表达均升高，但在小鼠肝脏和肝细胞中，ACT处理均可降低这些mRNA的表达（图5c；补充图S7a）。IRF1能够感知来自TLR-MyD88-TRIF通路的信号，并与CMPK2的启动子结合，进而诱导其转录[ 25 ]。随后，为了探究ACT是否通过IRF1影响CMPK2的转录，我们利用生物信息学预测网站JASPAR鉴定了IRF1在CMPK2上的靶位点（图5d ）。此外，我们在AML12细胞中进行的ChIP-qPCR实验结果证实，HR促进了肝细胞中IRF1与Cmpk2启动子或外显子2区域的结合，而ACT处理则显著逆转了这一过程（图5e）。随后，我们瞬时转染靶向Cmpk2 的siRNA ，或处理纯化的 CMPK2 蛋白，以验证 CMPK2 在触发 mtDNA 泄漏及其下游靶点后续变化中的不可或缺的作用。值得注意的是，Cmpk2的敲低与 ACT 具有协同作用，导致 mtDNA 含量降低（图 5f；补充图 S7b），抑制 Irf1 的核转位（图 5g；补充图 S7c ），进而影响Irf1和Hmgb1的转录（补充图 S7d ）。此外，重组 CMPK2 蛋白有效拮抗了 ACT 对 mtDNA-TLRs/NF- κB -IRF1 信号通路的治疗作用（图 5f）。和g；补充图 S7b和S7c）。此外，SPR 检测表明，ACT 能够与 IRF1 蛋白结合（图 5h），结合位点为：(TRP38 LYS39 HIS40 ALA41 ALA42 PRO74 LYS75 THR76 LYS78 ALA79 ARG82 MET85 ASN86 SER87 LEU88 PRO89 ILE91 GLU92 GLU93 VAL94 LYS95 GLN97 SER98 ARG99 ASN100 LYS101 SER103 SER104 ALA105 VAL106 ARG107)（图 5i，Vina 评分 = -7.4），这可能影响 IRF1 与 CMPK2 启动子区域的结合位置。
图5. CMPK2抑制剂与ACT联合用药可协同降低线粒体DNA合成和IRF1的核转位。(a) 原代肝细胞中IRF1潜在下游靶点的脉络图。(b) 主要潜在转录因子的预测分析。(c) AML12细胞中Cmpk2、 Hmgb1和Duox2的mRNA水平以Hprt1进行标准化。(d) CMPK2的预测转录序列。(e)通过ChIP分析检测Cmpk2启动子和外显子上的IRF1结合位点。(f) TOM20 (594 nm)、抗DNA (488 nm)、(g) IRF1 (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像，分别在用ACT、siCMPK2或重组CMPK2蛋白处理的AML12细胞中进行。比例尺 = 20 μm。 （h）ACT与IRF1结合的SPR结果。（i）ACT与IRF1的分子对接结果。统计学意义：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，与对照组相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，与模型组相比（数据以平均值±标准误表示， n = 3）。
抑制DUOX2或完全清除缺氧肝细胞分泌的mtDNA，可发挥与ACT类似的抗HIRI保护作用
由于DUOX2异常产生的ROS会加剧氧化应激和肝细胞损伤，我们检测发现HR组中DUOX2和CK18的共定位增加，而ACT处理可逆转这一现象（图6a；补充图S8a）。我们使用生物预测网站JASPAR分析DUOX2是否为IRF1的潜在下游靶点，并预测了其靶点结合位点（图6b ）。此外，我们在AML12细胞中进行的ChIP-qPCR结果表明，HR促进了肝细胞中IRF1与Duox2启动子或外显子1区域的结合，而ACT处理显著逆转了这一结合（图6c）。为了进一步证实DUOX2参与了AML12细胞中ROS的产生增加及其导致的氧化还原损伤，我们通过转染特异性序列的siRNA沉默了Duox2基因。靶向Duox2 的siRNA导致Duox2、Cmpk2、Hmgb1和Cxcl10的 mRNA 水平相应降低（图 6d），并且与接受 HR 处理的细胞相比，ROS 生成显著减少（补充图 S8b），这与 ACT 具有协同作用。正如预期的那样，HR 损伤后，胞质中释放的氧化型线粒体 DNA (ox-mtDNA) 水平（图 6e；补充图 S8c）和 IRF1 的核转位（图 6f；补充图 S8d）均增加，但 siDUOX2 与 ACT 联合给药可显著逆转这些变化。接下来，我们从不同肝细胞组的培养基中提取 mtDNA，并将纯化的 mtDNA 浓缩，用于进一步转染到另一组肝细胞中。如图 6g和6h所示，与 mtDNA-Con 组相比，mtDNA-HR 组中 TLR9 和 MYD88 的 mRNA 和蛋白水平上调，而 TLR2 的 mRNA 和蛋白水平未见上调。mtDNA-HR + ACT 可降低 TLR9 和 MYD88 的 mRNA 和蛋白水平，而 DNase I 干预则可完全阻断 TLR2 和 MYD88 的 mRNA 和蛋白水平的上调。此外，值得注意的是，DNase I 可拮抗 mtDNA-HR 转染引起的 IRF1 转录增加和核转位，以及随后 CMPK2 和 DUOX2 的表达（图 6g、i、j；补充图 S9a和S9b）。这些结果表明，氧化型线粒体 DNA (ox-mtDNA) 的生成和自分泌释放可能是 IRF1 的下游因子，也是最终的氧化损伤驱动力，同时也是 ACT 对抗 HIRI 保护机制的关键组成部分。
图 6. DUOX2 抑制和 ACT 给药协同降低了线粒体 DNA (mtDNA) 的生成和氧化，这对于 TLR-IRF1 通路的激活至关重要。(a) AML12 细胞中 CK18 (594 nm)、DUOX2 (488 nm) 和 DAPI (405 nm) 免疫荧光染色的代表性图像。比例尺 = 20 μm。(b) Duox2的预测转录序列。(c) 通过 ChIP 分析检测Duox2启动子和外显子上的 IRF1 结合位点AML12 细胞中Duox2、 Hmgb1、 Cmpk2和Cxcl10的 mRNA 水平以Hprt1进行标准化图 (e) 和 (f) 分别展示了经siDuox2和 ACT 处理的 AML12 细胞中 TOM20 (594 nm) 和 8-OHdG (488 nm) 以及 IRF1 (488 nm) 和 DAPI (405 nm) 的免疫荧光染色代表性图像。比例尺 = 20 μm。(g)将不同组别分离的纯化 mtDNA 转染到 AML12 细胞中，并以Hprt1进行标准化，检测Tlr9、 Tlr2、 Myd88和Irf1的 mRNA 水平。(h) 将 AML12 细胞中 TLR9、TLR2 和 MYD88 的蛋白表达水平以β-肌动蛋白进行标准化。图 (i) 和 (j) 分别展示了 AML12 细胞中 IRF1 (488 nm)、CMPK2 (594 nm)、DUOX2 (488 nm) 和 DAPI (405 nm) 的免疫荧光染色代表性图像。比例尺 = 20 μm。统计学意义：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，与对照组相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，与 HR 或 mtDNA HR组相比（数据以平均值 ± 标准误表示， n = 3）。
ACT 与 CMPK2 结合，并促进线粒体自噬依赖性的 CMPK2 降解
为了进一步探究ACT介导CMPK2降解的具体机制，我们首先在AML12细胞中应用DARTS和CETSA实验，发现ACT能够提高CMPK2的热稳定性并抑制蛋白酶对CMPK2的水解，提示ACT与CMPK2之间可能存在直接结合（图7a和b；补充图S10a）。分子对接的相互作用分析预测ACT与CMPK2具有很强的结合亲和力（补充图S10b）。为了进一步证实ACT与CMPK2的相互作用，我们采用SPR和MST技术，确定CMPK2是ACT的直接靶点（图7c和d；补充图S10和S10d）。接下来，环己酰亚胺 (CHX) 追踪实验表明，ACT 处理后 CMPK2 蛋白水平的降解得到促进（图 7e；补充图 S10e）。蛋白质稳定性主要受多种蛋白质降解途径的影响，包括泛素-蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径。为此，我们分别用 MG132 和巴弗洛霉素 A1 (BafA1) 处理 AML12 细胞以抑制蛋白酶体和溶酶体的活性，发现 BafA1（而非 MG132）能有效导致 ACT 存在下 CMPK2 的积累（补充图 S11a）。随后，我们使用溶酶体特异性荧光探针 Lyso-Tracker 定量分析溶酶体的生物合成，并检测 CTSB（组织蛋白酶 B，一种主要的溶酶体水解酶）的活性以确定溶酶体的功能。如图7f和7g以及补充图S11b和S11c所示，在HR条件下，ACT处理可增强Lyso-Tracker的红色荧光强度，而BafA1可逆转这一效应。同时，ACT促进了HR组中成熟CTSB水平的升高，但BafA1阻断了ACT诱导的pro-CTSB向成熟CTSB的转化。此外，我们发现HR+ACT组中CMPK2与溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）的共定位程度更高，并证实ACT促进了CMPK2与溶酶体的融合降解，而BafA1可逆转这一过程（图7h；补充图S11d）。
图7. ACT通过激活线粒体自噬 直接与CMPK2结合并诱导其降解。(a) CETSA和(b) DARTS检测。(c) SPR结果和(d) MST分析ACT与CMPK2的结合。(e) AML12细胞CHX追踪实验中CMPK2的蛋白表达以β-肌动蛋白进行标准化。(f) AML12细胞中Lyso-Tracker (594 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺 = 20 μm。(g) AML12细胞中前体和成熟CTSB的蛋白表达以β-肌动蛋白进行标准化。(h)、(i) AML12细胞中CMPK2 (488 nm)、LAMP-1 (594 nm)、LC3 (594 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺 = 20 μm。（j）AML12 细胞线粒体的代表性透射电镜图像。比例尺 = 20 μm。AML12 细胞中（k）PARKIN、LC3-I、LC3-II 和（l）CMPK2 的蛋白表达量以β -ACTIN 进行标准化。统计学意义：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，与相应对照组相比； # P < 0.05， ## P < 0.01， ### P < 0.001，与 HR 组相比。 $ $ $ 与 HR + ACT M + Mdivi-1 组相比， P < 0.001 （数据以平均值 ± 标准误差表示，n = 3）。
溶酶体介导的降解过程主要包括非选择性自噬和针对不同底物的选择性自噬，例如P62依赖性泛素化蛋白、P62依赖性受损线粒体（称为线粒体自噬）以及通过泛素化作用降解入侵微生物[ 26 ]。ACT给药后LC3/CMPK2的荧光比值上调，但分别被自噬抑制剂SAR405（抑制液泡蛋白分选34）和3-MA（抑制III类磷脂酰肌醇3-激酶）抑制（图7i；补充图S11e）。与CHX+ACT组相比，CHX+ACT+SAR405组或3-MA组中CMPK2的水平显著升高（补充图S11f）。接下来，我们试图探究是哪种自噬-溶酶体通路负责CMPK2的降解。透射电镜（TEM）结果显示，与HR组相比，ACT处理后的AML12细胞中形成了含有受损线粒体的自噬体（图7j）。随后，与HR组相比，ACT处理后PARKIN、LC3、PINK1和P62的蛋白水平显著升高，而P62的蛋白水平则降低（图7k；补充图S11g）。值得注意的是，小鼠肝脏中线粒体自噬标志物如PARKIN和PINK1的蛋白表达变化趋势与AML12细胞中的趋势一致（补充图S11h）。STX17、SNAP29和VAMP8构成SNARE蛋白复合物，该复合物在自噬体与溶酶体的融合过程中发挥关键作用。值得注意的是，与STX17和SNAP29相比，VAMP8的表达水平发生了显著变化（补充图S12a）。随后，我们设计了三种不同的VAMP8小干扰RNA（siRNA）用于敲低VAMP8，并筛选出最有效的VAMP8 siRNA用于进一步的CMPK2降解实验（补充图S12b）。补充图S12c显示，敲低VAMP8抑制了ACT促进CMPK2降解的作用。此外，我们用线粒体自噬激动剂（CCCP）或抑制剂（Mdivi-1）处理AML12细胞，并在HR损伤条件下检测ACT处理后CMPK2表达的变化。Mdivi-1处理明显减弱了HR+ACT组中CMPK2水平的下降趋势，而CCCP处理则加剧了这种下降趋势（图7l）。同时，免疫沉淀实验证实，ACT给药后CMPK2与P62和K63的结合均减少（补充图S12d）。以上结果表明，ACT通过促进线粒体自噬促进肝细胞中CMPK2的降解，但不影响泛素-蛋白酶体降解途径。
肝细胞特异性CMPK2过表达可直接抵消ACT的抗HIRI保护作用
为了进一步证实CMPK2介导的肝细胞脂质代谢损伤在缺血再灌注损伤（HIRI）中的作用，以及这种损伤是否为ACT治疗所特有，我们在HIRI手术和ACT预处理前，通过尾静脉成功注射了携带CMPK2并经ZsGreen荧光素标记的AAV8病毒至小鼠体内（图8a；补充图S13a）。肝功能指标（血清AST和ALT）以及脂质含量（血清FFA和总胆固醇[TC]）表明，肝细胞中CMPK2的过表达加剧了肝脏缺氧损伤和脂质代谢异常，即使给予ACT也无法缓解（图8b和c；补充图S13b）。同时，CMPK2过表达肝脏的组织学检查和TUNEL/HNF-4α共染色显示，存在明显的广泛炎症细胞浸润和肝细胞坏死，ACT干预后这些病变有所改善（图8d和e）。此外，注射携带CMPK2的AAV8病毒并接受ACT治疗后，肝脏中游离脂肪酸（FFA）水平降低（图8f）。为了进一步研究CMPK2过表达对肝脏脂质代谢的刺激作用，我们分析了不同组中氧化应激标志物（包括ROS、MDA和GSH）的变化。如图8g；补充图S13c和S13d所示，HIRI+AAV CMPK2组中DCFH-DA荧光染色和MDA水平均显著升高，而GSH含量降低，ACT干预后GSH含量变化不大。值得注意的是，与HIRI + AAV CMPK2组相比，ACT抑制了mtDNA向血清中的分泌（图8h）。这些结果表明，肝细胞中CMPK的爆发性增加直接刺激mtDNA的产生，同时影响由FFA过度氧化引起的ROS积累。此外，我们验证了各组中参与CMPK2中心信号通路的几个关键靶点的表达变化。在HIRI + AAV CMPK2组中，CMPK2、TLR9、MYD88、p-NF- κB和IRF1的表达均显著升高，而HMGB1、TLR2、ACOT2和DUOX2的表达则无显著变化；但在小鼠肝脏中预先给予ACT后，这些靶点的表达几乎没有变化（图8i和j；补充图S13e和S13f） 。综上所述，虽然ACT可以直接结合并抑制肝脏中CMPK2的表达，但它无法抵抗外源性CMPK2刺激引起的不良反应以及在HIRI条件下随之发生的脂质代谢紊乱。
图8. 肝细胞特异性过表达CMPK2显著阻断了ACT对小鼠肝脏的抗HIRI作用。(a) 小鼠肝脏中ZsGreen (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺 = 100 μm。(b) 不同组小鼠血清中ALT水平；(c) 不同组小鼠血清中FFA水平。(d) 使用Image J软件对H&E染色代表性图像进行定量分析。比例尺 = 100 μm。(e) 小鼠肝脏中TUNEL (594 nm)、HNF-4α (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺 = 100 μm。(f) 不同组小鼠肝脏中FFA水平。(g) 小鼠肝脏中ROS (488 nm)和DAPI (405 nm)免疫荧光染色代表性图像。比例尺 = 100 μm。（h）不同组别血清中线粒体DNA（mtDNA）水平。（i）小鼠肝脏中CMPK2、 Tlr9、 Myd88、 Irf1和Duox2的mRNA水平以Hprt1进行标准化。（j）小鼠肝脏中CMPK2、MYD88、p-NF- κB和IRF1的蛋白表达以β-肌动蛋白进行标准化。统计学意义：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，与假手术+AAV ev组比较。 $ $ " role="presentation"> $ $ P < 0.01， $ $ $ " role="presentation"> $ $ $ 与 HIRI + AAV CMPK2组相比， P < 0.001 （数据以平均值 ± 标准误差表示，n = 6）。
03
展 望
我们之前的研究表明，在减轻肝缺血再灌注损伤（HIRI）的过程中，及时阻断肝细胞的氧化还原损伤和线粒体功能障碍至关重要[ 17 ]。此外，如果肝细胞的脂毒性和死亡过程不能立即停止，将会进一步扰乱整个肝脏的代谢稳态，并引发更严重的炎症级联反应[ 27 , 28 ]。在本研究中，我们发现HIRI期间肝细胞中线粒体ACOT2的异常升高促进了乙酰辅酶A合成游离脂肪酸（FFA），进而刺激了以活性氧（ROS）增加为特征的氧化还原失衡（图1和图2）。对HIRI全肝组织和肝细胞测序数据的生物信息学分析表明，CMPK2表达显著上调，且与线粒体功能障碍和疾病进展呈正相关。重要的是，在ROS刺激的氧化环境下，CMPK2进一步促进了典型损伤相关分子模式（DAMP）——线粒体DNA（mtDNA）的氧化和合成，并通过肝细胞中线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放刺激其分泌（图3）。基于细胞的自分泌实验证实，从氧化肝细胞中纯化的mtDNA通过激活低氧化状态肝细胞中的TLR9-MYD88-NF- κB -IRF1信号通路，刺激了Cmpk2和Duox2的转录（图4和图5）。从机制上讲，ACT与IRF1结合，抑制其核转位以及下游靶基因的表达和功能，特别是抑制CMPK2刺激的mtDNA合成，同时降低DUOX2产生的ROS水平，从而改善HIRI或HR引起的病理现象（图6）。此外，图7表明，ACT促进CMPK2的翻译降解是通过线粒体自噬而非其他溶酶体或泛素介导的降解途径实现的。相反，肝细胞特异性Cmpk2过表达直接抵消了ACT在体内的抗HIRI保护作用（图8）。
脂肪酸是细胞膜的重要组成部分，也是重要的能量底物，直接影响线粒体功能的稳态。然而，脂肪酸在肝脏（尤其是肝细胞）中的积累会导致活性氧（ROS）过度产生和多种细胞死亡方式[ 29 ]。本研究发现，在缺血再灌注损伤（HIRI）期间，线粒体ACOT2（而非其他ACOT家族成员）异常升高，且与游离脂肪酸（FFA）水平呈正相关，而ACT可显著降低FFA水平。有趣的是，在缺氧条件下，ACOT2介导的FFA积累并未增强脂肪酸β-氧化；相反，它加剧了ROS的产生（图2）。高浓度的FFA诱导线粒体解偶联呼吸，导致质子重入而ATP无法生成，进而抑制呼吸链[ 30 , 31 ]。进一步研究表明，该机制可能涉及游离脂肪酸（FFA）作为辅助因子增强腺嘌呤核苷酸转位酶2（ACOT2）的质子通透性，从而加速线粒体呼吸的解偶联和线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放。这会加剧线粒体活性氧（ROS）产生的紊乱，形成脂毒性-高氧化-炎症的恶性循环[ 32 ]。给予ACT后，ACOX1的诱导和CMPK2的下调协同恢复了正常的FFA氧化和整个线粒体功能。此外，它还导致FFA生成减少，部分原因归因于ACOT2水平的降低。然而，在HIRI下CMPK2和ACOT2靶点的损伤优先性和相互作用模式，以及潜在的药物靶点，仍需进一步研究。
CMPK2是线粒体内氧化型mtDNA片段生成所必需的。当FEN1切割ox-mtDNA后，其片段通过线粒体通透性转换孔（mPTP）释放到细胞质中，激活NLRP3-cGAS-STING-IFN-γ通路并诱导炎症[ 33 ] 。CMPK2还通过后续的ox-mtDNA-cGAS-STING信号通路直接促进NLRP3炎症小体的激活和巨噬细胞的募集，使其成为代谢性肝病进展过程中的关键介质[ 14 , 34 , 35 ]。ACT可降低HIRI或HR引起的CMPK2转录，并减少mtDNA合成，同时伴有TOM20和8-OHdG探针共染色强度的降低（图3）。这些结果表明，ACT抑制缺氧肝细胞中线粒体DNA（mtDNA）的合成、氧化和释放。有趣的是，在这些条件下，ACT对IFN-γ的表达影响不大，这表明它可能影响除cGAS-STING通路以外的mtDNA其他下游通路。由于其未甲基化的CpG基序，释放的mtDNA也被报道可激活不同的分子信号通路，例如模式识别受体。值得注意的是，这种mtDNA依赖性激活表现出一定的敏感性，对TLR9具有特异性偏好，而TLR9反过来又通过NF-κB相关通路诱导一系列炎症反应[ 36 ] 。尽管在HIRI条件下TLR2和TLR9均上调，但ACT显著降低了这两种受体的表达，且对TLR9的影响更为显著（图4e）。此外，ACT抑制了TLR9-MYD88-NF- κB通路，降低了IRF1的核转位及其后续的CMPK2转录表达以及mtDNA合成。值得注意的是，我们最近发现缺氧增强了HMGB1的释放，HMGB1通过TLR2受体进一步增强了IRF1的核转位和功能，并伴有巨噬细胞浸润[ 4 ] 。本研究进一步证实了HIRI可能通过不同的DAMPs激活IRF1转录，以及ACT的协同抗氧化和抗炎保护作用（图3、4、6）。更重要的是，给予ACT后，FFA过度积累、线粒体呼吸解偶联和mPTP开放均得到逆转，从而阻断了mtDNA的外排-识别-摄取-激活循环，形成保护性环路。
尽管CMPK2在肝脏中的基础表达水平相对较低，但我们观察到在缺氧刺激下，肝细胞线粒体内的CMPK2水平显著升高，而ACT处理后，这种升高被显著逆转（图3d，下半部分）。除了影响CMPK2的转录外，ACT还显著降低了CMPK2蛋白的稳定性（图7e），但对其mRNA稳定性没有影响（数据未显示）。此外，ACT与MG132或BafA1联合处理后观察到的差异表明，ACT通过自噬-溶酶体途径降解CMPK2，这可能解释了其促进CMPK2与溶酶体标志物LAMP1共定位的原因（图7h）。除了影响其他经典的自噬-溶酶体降解途径外，ACT还激活了线粒体自噬相关蛋白的表达，特别是PARKIN、PINK1、LC3和VAMP8。值得注意的是，即使在存在ACT的情况下，使用SAR405和3-MA抑制自噬早期阶段、使用mdivi-1抑制线粒体自噬或沉默肝细胞中的VAMP8，均能显著观察到CMPK2的积累（图7l；补充图S11f、S12c ）。这些结果表明，ACT特异性地促进P62依赖的CMPK2线粒体自噬降解，揭示了一种靶向降解CMPK的新机制。P62能够将泛素化的底物（例如受损线粒体上的PARKIN）与自噬体膜连接起来，这依赖于UBA结构域内的特定翻译后修饰[ 37 ]。然而，我们初步发现ACT不影响TBK1和ULK1（负责P62在Ser349和Ser407位点的磷酸化）的激活，也不影响TIP60的表达（负责P62在K420位点的乙酰化）（数据未显示）。在通过SPR和MST实验证实ACT可以与CPMK2结合后，我们还预测了潜在的特异性结合位点（GLY10、GLY11、PRO12、GLY13、ALA14、GLY15、LYS16、GLY17、THR18、HIS31、SER33、ALA34和GLY35）。 ACT 是否通过与受损线粒体中积累的 CMPK2 结合，帮助 P62 执行 PARKIN 依赖的线粒体外膜泛素化和随后的自噬，以及这一过程是否与 CMPK2 上的特定结构域有关，值得进一步研究。
【Citation】:Luo R, Yang Y, Che X, et al. Acteoside mitigates hepatic ischemia-reperfusion injury by targeting CMPK2-intervened redox metabolism[J]. Targetome, 2026, 2(2).
【贡献】★★★★★
综上所述，我们的研究强调了 CMPK2 驱动的异常氧化还原代谢在 HIRI 发病机制中的重要性，并突出了其作为新型治疗靶点与天然生物活性化合物（如 ACT）联合干预的潜力。
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