α-红没药醇是一种主要源于洋甘菊等植物中的倍半萜醇，具有镇痛、舒缓皮肤、抗炎等功效，具有很大的开发价值及临床应用前景。
传统的生产方式如植物提取法和化学合成法均存在诸多问题。植物提取法往往受植物生长周期长、提取效率低和环境影响大等因素限制；在化学合成中，由于 α-红没药醇有两个手性中心和四种立体异构体，生产时需要增加额外的纯化步骤，在提高生产成本的同时还会带来环境污染。因此，开发一种既经济又绿色的工业生产方法迫在眉睫。
近日，来自江南大学蔡宇杰研究团队的一篇题为“Constructing High-Yielding Serratia marcescens for (−)-α-Bisabolol Production Based on the Exogenous Haloarchaeal MVA Pathway and Endogenous Molecular Chaperones”的研究中，研究人员利用合成生物学和代谢工程策略，重新设计粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens)，引入嗜盐古菌型甲羟戊酸（MVA）途径和 α-红没药醇生物合成途径，成功构建了一种无需诱导即可高效生产 α-红没药醇的工程菌株，为 α-红没药醇的大规模工业化生产提供了可能性，也为在非模型微生物中无需诱导即可生产 α-红没药醇提供了指导。
目前，α-红没药醇的微生物生产主要依靠大肠杆菌和酿酒酵母作为底盘菌株，但高浓度的 α-红没药醇对菌株有一定毒性，限制了产量的进一步提升。粘质沙雷菌以其强大的适应性和代谢多样性，成为生产 α-红没药醇的理想宿主。因此在本研究中，研究团队首先筛选出耐受萜类化合物的粘质沙雷氏菌 HBQA7，并对其进行了工程化改造。
随后，通过引入外源性的嗜盐古菌型 MVA 途径和 α-红没药醇生物合成途径，研究人员成功构建了能够产生 α-红没药醇的菌株，并结合不同来源的 FPPS 和 BOS 基因，在组成型启动子的调控下，初步实现了 α-红没药醇的高效生物合成。
然而在合成过程中，研究团队发现萜烯合酶基因表达虽高，但蛋白质合成过快导致新生蛋白折叠不充分，易形成无生物活性的包涵体，影响产物产量。为解决这个问题，研究人员采用分子伴侣共表达策略，从粘质沙雷氏菌基因组中选择了 IbpA/B、DnaK/J 和 Trigger factor 三种内源性分子伴侣，以协助 α-红没药醇合酶正确折叠。
实验结果表明，伴侣蛋白 DnaK/J 的共表达显著提高了 α-红没药醇合酶的可溶性表达，使 α-红没药醇产量提高了 10%。
合成过程中，研究人员在发酵过程中检测到了副产物法尼醇的生成。他们推测可能是内源性磷脂酶与 α-红没药醇合酶竞争底物 FPP，降低产量。在通过转录组数据分析，确定了几个可能的磷脂酶基因后，研究团队利用 CRISPR-Cas9 系统分别敲除这些基因。实验发现，敲除 PhoA 基因后，法尼醇产量显著降低，α-红没药醇产量提高到 3.21 g/L。
为了实现大规模生产，研究还采用了补料分批发酵工艺，研究团队在 5 L 生物反应器中进行规模化实验时，利用甘油为额外碳源，通过添加正十二烷实现原位提取，减少产物积累对细胞生长的抑制，并在发酵过程中，合理控制甘油进料和 pH 值，使菌株在高效合成阶段生产大量 α-红没药醇。最终，α-红没药醇产量达到 30.2 g/L，为目前报道的最高产量，充分展示了粘质沙雷氏菌生产 α-红没药醇的巨大潜力。
总而言之，目前通过合成生物学和代谢工程策略构建高产粘质沙雷氏菌用于生产 α-红没药醇取得了显著进展。但研究仍存在诸多可提升之处，例如，α-红没药醇合酶作为关键酶，其活性提升对于提高产量至关重要。目前，虽然通过分子伴侣共表达策略在一定程度上改善了其可溶性表达，但酶活性仍未达理想状态，存在进一步优化的潜力，以及粘质沙雷氏菌在生产过程中会产生如 2,3 - 丁二醇和乙酸等次级代谢产物，这一现象会分散代谢通量，使原本可用于 α-红没药醇合成的乙酰辅酶 A 等前体物质被分流，从而限制了 α-红没药醇的最终产量。
相信未来，随着这些研究方向的深入，微生物合成 α-红没药醇技术有望取得进一步突破，也将进一步提升 α-红没药醇的生产效率和经济效益。
参考文献：
1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c10135
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