Adv Sci丨揭示NUP85是肝纤维化的关键驱动因子|主题是遏制肝硬化|介导|免疫|特异性|细胞|肝纤维化|胶原

肝纤维化是慢性肝病向肝硬化、肝癌进展的关键病理阶段，全球约有 3.3% 的人群存在晚期肝纤维化。然而，临床上至今尚无获批的抗肝纤维化药物，其背后的分子机制和有效干预靶点一直是该领域亟待突破的核心难题。近年来，靶向肝星状细胞（ HSCs ）被认为是治疗肝纤维化最有前景的方向之一。但核孔蛋白 NUP85 在这一过程中究竟扮演什么角色？此前从未被系统研究过。

近日，安徽医科大学徐涛教授团队联合中科大附属第一医院陈昭琳教授在 Advanced science 杂志在线发表题为 NUP85 Mediates Endoplasmic Reticulum Stress through the USP47/ASK1 Signaling Pathway to Regulate the Progression of Liver Fibrosis 的研究论文揭示：NUP85是肝纤维化的关键驱动因子。此外，研究团队开发了靶向活化HSCs的CREKA肽修饰脂质体递送系统，将NUP85小分子抑制剂MogrosideV精准递送至活化的HSCs，实现了安全、高效的治疗效果。

首先，为评估 NUP85 与肝纤维化进展的相关性，分析了多个 GEO 数据集（ GSE55747 、 GSE25097 、 GSE84044 、 GSE15654 ）。结果显示，在 CCl ₄ 诱导的肝纤维化、肝硬化及晚期纤维化（ S2-4 ）患者中， NUP85 表达均显著上调，且肝癌肝硬化患者高于非肝癌肝硬化患者； NUP85 表达与 ACTA2 、 Col1A1 、 Col3A1 等纤维化标志物呈显著正相关（ r=0.581 、 0.300 、 0.413 ）。进一步在临床肝纤维化患者及小鼠模型中进行验证， H&E 、 Masson 、天狼猩红染色证实了典型的纤维化病理改变，免疫荧光、免疫组化、 Western blotting 及 RT-qPCR 均显示 NUP85 表达显著升高。在 TGF-β1 激活的 LX-2 细胞中， NUP85 表达同样上调。原代细胞分离实验表明， NUP85 主要在活化的 HSCs 中选择性上调，而在肝细胞和肝巨噬细胞中变化不显著，该现象在 CCl ₄ 及 BDL 两种模型中均得到验证。以上结果为 NUP85 表达水平与肝纤维化进展之间的显著相关性提供了充分证据。

接下来，为探究 NUP85 在肝纤维化中的作用，分别构建了肝特异性（ AAV8 介导）和 HSCs 特异性（ AAV2-Lrat 介导） NUP85 敲低小鼠模型。在 CCl ₄ 及 BDL 两种肝纤维化模型中，肝特异性敲低 NUP85 可显著降低血清 ALT 、 AST 、 ALP 水平，减少羟脯氨酸含量，减轻 Masson 及天狼猩红染色显示的胶原沉积面积，并下调纤维化标志物 α-SMA 、 Col1A1 、 Col3A1 的 mRNA 及蛋白表达。 HSCs 特异性敲低 NUP85 同样改善了上述肝损伤及纤维化指标。为进一步验证 NUP85 的促纤维化功能，在 NUP85 敲除小鼠中通过 AAV2-Lrat-oeNUP85 恢复（过表达） NUP85 ，结果显示 ALT 、 AST 、 ALP 及羟脯氨酸含量升高，胶原沉积面积扩大， α-SMA 、 Col1A1 、 Col3A1 表达上调，纤维化程度显著加剧。以上结果表明， NUP85 在肝纤维化中发挥促纤维化作用，且该作用主要依赖于 HSCs 中的 NUP85 。

为探究 NUP85 在 HSCs 活化中的作用，首先确定 TGF-β1 的最佳刺激条件（ 10 ng/mL 处理 24 小时），此条件下 NUP85 蛋白表达达峰值。随后验证了 NUP85-siRNA 和过表达质粒的转染效率，确认其可有效敲低或上调 NUP85 表达。功能实验表明，在 TGF-β1 诱导的 LX-2 细胞中，敲低 NUP85 可显著降低纤维化标志物 α-SMA 、 Col1A1 和 Col3A1 的 mRNA 及蛋白水平，而过表达 NUP85 则上调这些标志物。在原代小鼠 HSC 中， NUP85 敲低同样抑制了细胞自发活化，表现为上述标志物表达降低。以上结果表明，敲低 NUP85 可有效抑制 TGF-β1 诱导的 HSCs 活化。

为阐明 NUP85 调控肝纤维化的分子机制，对正常和 NUP85 敲低小鼠肝组织进行 RNA-seq ， GO 富集分析显示内质网应激（ ERS ）通路显著受影响。体内外验证表明，在 CCl ₄ 诱导的小鼠及 TGF-β1 刺激的 LX-2 细胞中，敲低 NUP85 可显著降低 ERS 标志物（ GRP78 、 ATF4 、 p-IRE1 、 CHOP ）的表达，而过表达 NUP85 则升高这些标志物水平。为进一步验证 ERS 在 NUP85 调控肝纤维化中的关键作用，使用 ERS 激活剂衣霉素（ TM ）进行回补实验。结果显示， TM 处理可部分逆转 NUP85 敲低对 ERS 、肝损伤及胶原沉积的抑制作用，表现为 ERS 标志物及纤维化标志物（ α-SMA 、 Col1A1 、 Col3A1 ）表达回升，血清 ALT 、 AST 、 ALP 及羟脯氨酸含量增加， Masson 和天狼猩红阳性面积扩大。以上结果表明， ERS 是 NUP85 调控肝纤维化进程的关键介导因素。

为进一步阐明 NUP85 在肝纤维化中的作用，对 RNA-seq 数据进行聚类分析和 KEGG 通路富集分析。结果显示，对照组与 NUP85 敲低组小鼠的基因表达模式存在显著差异，其中 MAPK 信号通路是最显著改变的通路。体内外验证表明，在 CCl ₄ 诱导的小鼠及 TGF-β1 刺激的 LX-2 细胞中， NUP85 敲低可抑制 ASK1 、 JNK 、 p38 的磷酸化激活，而 NUP85 过表达则增强其磷酸化水平。功能回补实验进一步证实，腺病毒介导的 ASK1 过表达可逆转 NUP85 敲低对 HSC 活化的抑制效应；而 ASK1 特异性抑制剂 GS-4997 则可消除 NUP85 过表达驱动的促活化效应。此外， NUP85 对内质网应激的调控同样依赖于 ASK1 信号通路。以上结果表明， ASK1 是 NUP85 调控肝纤维化进程的关键下游靶点。

为阐明 NUP85 调控 ASK1 活性的机制，检测了 ASK1 的泛素化和磷酸化水平。结果显示，肝纤维化中 ASK1 的泛素化及磷酸化水平均升高，且 NUP85 可正向调控二者水平。使用泛素化抑制剂 TAK-243 可阻断 NUP85 对 ASK1 的调控作用，而广谱激酶抑制剂无此效应，提示 NUP85 通过泛素修饰影响 ASK1 磷酸化活性。通过 IP-MS 联合 RNA-seq 筛选，结合免疫共沉淀和免疫荧光验证，发现 NUP85 与去泛素化酶 USP47 存在直接相互作用，且 NUP85 可正向调控 USP47 的表达水平。在 TGF-β1 诱导的 LX-2 细胞中进行 NUP85 与 USP47 的共敲低实验，结果显示同时敲低 USP47 可部分逆转 NUP85 敲低对纤维化标志物（ α-SMA 、 Col1A1 、 Col3A1 ）及内质网应激标志物（ GRP78 、 ATF4 、 CHOP 等）的抑制作用。以上结果表明， NUP85 通过与 USP47 结合，调控肝星状细胞活化和内质网应激，从而促进肝纤维化进展。

为探究 NUP85 通过 USP47 调控 ASK1 泛素化的机制，首先验证了 USP47 与 ASK1 的相互作用。免疫荧光和免疫共沉淀显示，二者在 LX-2 细胞中共定位且直接结合。 USP47 过表达未影响 ASK1 的 K48 泛素化，但显著抑制其 K63 泛素化。竞争性实验表明， NUP85 与 ASK1 竞争结合 USP47 的 C19C 结构域。通过 LC-MS/MS 鉴定出 ASK1 上四个潜在泛素化位点（ K454 、 K458 、 K805 、 K1081 ），进一步构建点突变体进行功能验证，发现 K805R 突变可阻断 NUP85 和 USP47 对 ASK1 泛素化水平的调控，而其他位点突变无此效应。经质谱独立验证， K805 为 ASK1 的关键泛素化位点。以上结果表明， NUP85 通过 USP47 介导 ASK1 第 805 位赖氨酸的去泛素化修饰。

为进一步探究 NUP85 的治疗潜力，通过虚拟筛选和分子对接发现天然产物罗汉果苷 V （ MV ）可靶向 NUP85 ， CETSA 验证了其结合能力。 10~80 μM 的 MV 对 LX-2 细胞无毒性，且呈剂量依赖性抑制 α-SMA 和 Col1A1 表达。在 CCl ₄ 诱导的肝纤维化小鼠中， MV 灌胃处理可降低血清转氨酶水平、减轻胶原沉积、下调纤维化标志物及 ERS 标志物。为提高靶向性，构建了 CREKA 肽修饰的 PEG 化脂质体包载 MV （ CREKA-Lip/MV ），粒径约 110 nm ，球形均一，可持续释放。体内成像显示 CREKA 修饰显著增强脂质体在纤维化肝脏中的富集。与游离 MV 相比， CREKA-Lip/MV 更能有效降低血清 ALT 、 AST 、 ALP 及羟脯氨酸含量，减少胶原沉积，下调 NUP85 及纤维化标志物表达。体外实验同样显示 CREKA-Lip/MV 较游离 MV 更显著抑制 LX-2 细胞活化。 CCK-8 及主要器官 H&E 染色证实其生物安全性良好。以上结果表明， CREKA-Lip/MV 通过靶向 HSCs 中的 NUP85 安全有效地缓解肝纤维化。

本研究揭示了 NUP85 是肝纤维化的关键驱动因子。 NUP85 在纤维化肝组织中显著上调，尤其在活化的 HSCs 中。敲低 NUP85 可减轻 CCl ₄ 和 BDL 诱导的小鼠肝纤维化，过表达则加剧。机制上， NUP85 竞争性结合去泛素化酶 USP47 ，阻断其对 ASK1 的 K63 去泛素化，增强 ASK1 磷酸化及下游 JNK/p38 信号，诱导内质网应激，促进 HSCs 活化。靶向 NUP85 的天然产物罗汉果苷 V （ MV ）可抑制纤维化，而 CREKA 肽修饰的脂质体递送 MV （ CREKA-Lip/MV ）能靶向活化的 HSCs ，安全高效地缓解肝纤维化。 NUP85-USP47-ASK1 轴是肝纤维化治疗的潜在新方向。

全文链接： https://doi.org/10.1002/advs.202519972

徐涛教授，博导，博士后合作导师，发表论文 160 篇，其中 SCI 第一作者 / 通讯作者 80 余篇，多篇刊登于中科院 1 区 TOP 期刊。兼任 eGastroenterology 编委，《 Oncologie 》编委 , World Journal of Integrated traditional and western Medicine （ WJIM) 青年编委， Medicine Advances 青年编委，《中国药理学通报》杂志青年编委 , 《现代药物与临床》杂志青年编委。课题组因发展需要，长期招聘博士及博士后科研人员，热忱欢迎具有肝脏和生物学相关背景，有志于机制探索与药物研究的青年才俊加入，也欢迎本科生和硕士生报考本课题组的研究生。

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