樱花素（Sakuranetin）作为一种从樱花中提取出的黄酮类化合物，其具有卓越的高抗氧活性，还被验证具有特殊的抗病毒、抗癌、抗炎、抗过敏等特性，以及神经保护作用。在保健品、药品及护肤品领域都有着巨大的应用前景。
传统上，樱花素主要通过植物提取获得，这种方法常常受限于自然条件和生物质供应。随着合成生物学的发展，研究人员已经在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中构建了一条从葡萄糖出发合成樱花素的生物合成路径。
近日，南京师范大学的研究团队在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上发表了 “Multimodule Synthetic Redesign of Intracellular Metabolisms for the High-Titer de Novo Production of Sakuranetin in Yarrowia lipolytica” 一文，通过多模块工程策略对解脂耶氏酵母进行改造，实现了以葡萄糖为底物高效合成樱花素，为樱花素的可持续大规模生产提供了可能。
樱花素的生物合成路径涉及将葡萄糖转化为樱花素的多个步骤。首先，葡萄糖通过糖酵解和磷酸戊糖途径转化为磷酸烯醇丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸，这些中间体进一步被 3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶转化为 DAHP，进入莽草酸途径，最终形成酪氨酸，这是樱花素的直接前体。
为了提高樱花素合成的催化效率，研究人员采取了多模块工程策略，包括优化樱花素合成途径、设计甲基供体 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）再生系统、增加丙二酰辅酶 A 前体供应以及构建反馈抑制解除的莽草酸途径等，各模块相互配合、层层递进，有效提高了樱花素的产量。
研究人员首先将来源于水稻的编码柚皮素 7-O-甲基转移酶的基因 NOMT 导入解脂耶氏酵母菌株，构建了菌株 YliNOMT，初步实现了樱花素的合成。随后再次引入了来自不同物种的五个基因（Pc4CL、RtTAL、PhCHS、MsCHI 和 NOMT），构建了完整的樱花素生物合成途径，菌株 YlipSaK1 得以产生樱花素。这些基因分别编码 4-香豆酸-CoA 连接酶、酪氨酸氨裂解酶、查尔酮合酶、查尔酮异构酶和柚皮素 7-O-甲基转移酶，在樱花素的合成过程中发挥着关键作用。
对上述五个基因进行过表达分析，发现 PhCHS、MsCHI 和 RtTAL 的过表达分别使樱花素产量显著提高，表明这些基因在樱花素合成途径中可能存在催化效率限制，是影响产量的关键因素。例如，过表达 PhCHS 的菌株 YlipSaK3 樱花素产量达到 143.1 mg/L，相比初始菌株 YliSaK1（17.4 mg/L）提高了 8.2 倍。然而，进一步引入额外的 PhCHS 基因构建菌株 YlipSaK7 时，樱花素产量却下降了，这可能是由于质粒过大影响了遗传稳定性，提示在基因操作过程中需要平衡基因表达量和遗传稳定性之间的关系。
不仅如此，SAM 作为甲基供体，在樱花素合成中也起着至关重要的作用，参与了柚皮素向樱花素的转化反应。为了探究 SAM 供应对樱花素合成的影响，研究人员通过向菌株 YliNOMT 中补充不同浓度的 SAM 前体 L-甲硫氨酸，发现添加适量甲硫氨酸时樱花素产量显著增加，这表明 SAM 供应受限是限制樱花素合成的一个因素。因此，研究人员构建了 27 种重组质粒，用于调控 SAM 再生途径中相关基因（SAH1、MET6、SAM1）的表达，以优化 SAM 的再生。这一 SAM 补充途径使樱花素产量大幅提高。例如，在菌株 YliSaK-G7 中导入优化后的重组质粒后，樱花素产量从 87.8 mg/L 提高到 165.9 mg/L，提高了 88.9%。
此外，研究人员还采取了其他策略，如通过引入乙酰辅酶 A 羧化酶突变体 ACC1_S659A、S1157A 并敲除 YPL062W 以加强丙二酰辅酶 A 的供应，丙二酰辅酶 A 是樱花素的另一种合成前体，并解除莽草酸途径中 DAHP 合酶和分支酸变位酶受到的反馈抑制，以及将高产基因 YALI0C01859g 整合到菌株 YliSaK-G13 的基因组中，构建菌株 YliSaK-G14。
最终通过以上策略，研究团队成功改造了解脂耶氏酵母，显著提高了樱花素的产量，菌株 YliSaK-G14 产生了 344.0 mg/L 樱花素，葡萄糖产率为 2.9mg/g，最大细胞密度达到 39.9，表明该菌株有望用于樱花素的大规模可持续生产。
总而言之，这项研究中的樱花素生物合成路径为我们展示了合成生物学在生产高价值化合物方面的潜力，也为未来从可再生资源到高附加值产品的转化提供了新的可能性。利用基因工程和代谢工程策略，可以显著提高微生物生产天然产物的效率和可持续性。
1. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c09625
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