《食品科学》：广西大学王成华教授等：天然乳酸乳球菌硒蛋白表达机制及酶活特性|乳酸菌|天然乳酸乳球菌硒蛋白表达机制及酶活特性|广西大学|活性|王成华|食品科学

关于乳酸菌和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的关联研究，现有文献主要聚焦于乳酸菌的抗氧化性能上，而关于GPx在乳酸菌中的异源表达则相对有限；在其基因改造领域，大肠杆菌（

Escherichia coli

）作为表达系统的应用最为广泛，然而，利用乳酸菌作为宿主菌进行表达的研究鲜见报道。乳酸乳球菌被美国食品药品监督管理局认定为一般公认安全（GRAS）微生物，是乳酸菌中最具代表性的菌株之一。由于其生长速度快、操作简便且遗传背景清晰，乳酸乳球菌已成为基因工程常用宿主菌。

广西卫生职业技术学院的彭静静，广西大学轻工与食品工程学院的岳世阳、王成华*等人选择目前应用最为广泛的模式乳酸菌NZ9000，旨在探究天然乳酸乳球菌合成硒蛋白的能力与特性。

目前，仅大肠杆菌的硒蛋白生物合成与插入途径（SBIP）机制得到了较为明确的解析，且其调控因子在大肠杆菌中的同源过表达已被用于外源硒蛋白的表达，然而，SBIP在其他宿主菌中的代谢途径改造鲜见报道，乳酸菌中硒蛋白的生物合成及其调控因子的研究也不深入。通过NCBI基因组检索及原核生物硒蛋白基因预测程序bSECIS的比对分析，发现乳酸菌中缺乏硒蛋白编码基因及硒蛋白生物合成的相关调控因子。因此，本研究利用实验室保存的重组质粒pNZ8148

GPx

，通过在

GPx

的 3 个半胱氨酸位点（ C36 、 C63 、 C81 ）和倒数第 2 个的赖氨酸位点（ L156 ）的密码子位置引入编码硒代半胱氨酸（ Sec ）的终止密码子 UGA 和顺式作用元件硒代半胱氨酸插入元件（ SECIS ），尝试在 GPx 重组乳酸菌 NG1（

L

lactis

NZ9000/pNZ8148-GPx ）内通过定点突变和反向长距聚合酶链式反应（ PCR ）构建 5 个硒蛋白突变体。最终，对比这些突变体与本底菌 NG1 ，探讨在缺乏大肠杆菌 SBIP 途径中

SelA

（ Sec 合成酶）、

SelB

（特异翻译延伸因子）、

SelC

（特异性识别 UGA 的 tRNA [Ser]sec ）和

SelD

（硒代磷酸合成酶）基因元件的情况下，仅引入 UGA 和 SECIS 的乳酸乳球菌对原核型或真核型硒蛋白基因的表达情况，以期为后期构建新型硒蛋白及其乳酸菌细胞工厂提供参考。

LlGPx及其乳酸菌突变体的构建

E. coli

MC1061/pNZ8148-GPx和5 个大肠杆菌MC1061突变体所提质粒电转到L. lactis NZ9000，将长出的单克隆乳酸菌菌株分别扩培和提质粒后的酶切验证如图2所示。

如图2a所示，乳酸菌NZ9000内的pNZ8148

GPx

在3 620 bp 处出现单一条带， 5 个突变体重组质粒也均在3 000 ～ 4 000 bp 中间位置出现条带，与理论值预期相符。而图 2b 表明，乳酸菌 NZ9000 内的 pNZ8148

GPx

在 3122 bp处和 498 bp 处分别显示出条带， 5 个突变体重组质粒也分别在 3 000 bp 和 500 bp 的邻近位置出现条带，与理论值预期相符。说明以上重组质粒均电转成功。为了进一步验证 C36U 、 C63U 、 C81U 、 L156U 和 L156U-Ter在乳酸菌内构建的准确性，将所提质粒送去华大基因公司测序（图 3 ），测序结果用 Vector NT1 比对后表明它们的同源相似度为 100% ，即乳酸菌 LlGPx 的 5 个突变体构建成功。

LlGPx及其突变体基因重组乳酸菌的SDS-PAGE验证

2.1 LlGPx的富硒表达验证

借助于末端融合的组氨酸标签（6×His tag），采用镍离子金属螯合亲和层析纯化了富硒诱导培养的重组LlGPx，SDS-PAGE验证和分离纯化结果如图4所示。图4a 表明，富硒诱导后的NG1提取的粗酶液和纯酶液中均出现表观分子质量约为17.8 kDa的目的条带，与LlGPx的理论分子质量大小相符。图4b的亲和层析纯化结果显示，在洗脱液为20%的梯度（即咪唑浓度为116 mol/L）时，获得一个峰形好的蛋白组分峰，即为LlGPx。综上，8 μg/mL的Na2SeO3富硒诱导条件实现了LlGPx的过表达。这与许多研究者利用乳酸菌将培养系统中的无机硒进行富集并转化成有机硒的结论一致。

2.2 LlGPx突变体基因重组乳酸菌的表达验证

LlGPx突变体基因重组乳酸菌在无Nisin诱导、Nisin诱导后以及富硒诱导后的SDS-PAGE验证如图5所示。5 个突变体重组乳酸菌在无诱导（5～9泳道）时，没有在对应的位置出现截短体或完整硒蛋白条带，表明在pNZ8148

-GPx

的不同位置引入顺式作用元件（SECIS）和表达Sec的密码子（UGA），野生型乳酸乳球菌NZ9000均不支持突变体中Sec的表达或表达量很低以至于检测不出。此外，该结果不受Nisin诱导或者富硒诱导的影响。从以上结果可以推断，以NZ9000为代表的天然乳酸乳球菌中缺乏与大肠杆菌SBIP的同功能元件（如SelA～SelD），故无法按这个途径过表达含Sec硒蛋白。即使单一引入SECIS或将其他位点突变为表达Sec的UGA，也没法改变它本身对Sec不表达或表达率超低的现状。因此，乳酸菌本身能产硒蛋白的机制值得进一步被探讨。为了进一步确认实验结果，实验后期对这5 种突变体诱导后经镍离子金属螯合柱（Ni-NTA柱）层析洗脱纯化，但没有得到如NG1诱导后的峰型图和较纯的LlGPx（图4）。

LlGPx及其突变体的酶活性差异比较

由图6可知，相对于原始的NG1，分别与无诱导和Nisin诱导的GPx活性最接近的是L156U和L156U-Ter，与富硒诱导后活性最接近的是C36U和L156U-Ter。其次，几个实验组均出现统一的规律：对于所有样品粗酶液的GPx活性，均是无诱导组最低，Nisin诱导组活性居中，而富硒诱导后最高（其中，富硒诱导下LlGPx活性为89.10 mU/mg，突变体的GPx活性为56.17～84.45 mU/mg，两者差异小）。主要是因为：一方面，利用乳酸菌NICE系统，添加Nisin诱导剂可提高蛋白的表达量；另一方面，乳酸菌接种到含亚硒酸钠的液体培养基中并在37 ℃温度下静态培养能显著提高乳酸菌GPx活性。然而，突变体乳酸菌无论是否诱导，活性都是非常低（28.03～84.45 mU/mg）。综上，Nisin和富硒诱导均可使原始菌NG1和5 个突变菌的活性有显著性的提高，但诱导与否的粗酶液LlGPx活性不存在数量级的差别。

根据活性位点氨基酸的不同，GPx一般分为两类：1）活性中心为Sec的含硒GPx：包括GPx1、GPx2、GPx3、GPx4和GPx6；2）活性中心为Cys的非硒GPx：包括GPx5、GPx7和GPx8。因含硒GPx被证实具有更高的活性。因此，本研究尝试将GPx上的Cys替换为Sec。然而即使引入编码Sec的UGA和Sec插入元件SECIS，UGA在5 个乳酸乳球菌突变体中的通读率仍非常低以至于没有检测出含Sec硒蛋白的表达（图5），检测到的GPx活性很可能归因于NZ9000基因组GPx基因的本底表达，也可能存在包括微量Sec随机掺入在内的UGA通读生成重组GPx的机制，这有待进一步研究。

结论

本研究通过在乳酸乳球菌内构建LlGPx及在其不同位置引入顺式作用元件SECIS和表达Sec的密码子UGA，构建了5 个LlGPx突变体（C36U、C63U、C81U、L156U、L156U-Ter），以研究天然乳酸乳球菌对原核型和真核型硒蛋白的合成情况。通过酶切和测序验证5 个LlGPx突变体构建成功。在Nisin或富硒诱导条件下，对5 个乳酸菌突变体的粗酶液进行SDS-PAGE验证，结果表明均没有在预期位置出现显著的硒蛋白完整或截断条带。同时在无诱导、Nisin诱导和富硒诱导3 种培养条件下检测到的GPx活性均很低（28.03～84.45 mU/mg），不存在数量级的差别。综上，由于NZ9000缺乏大肠杆菌SBIP途径内合成Sec的关键基因元件（即