我国是肝脏疾病高负担国家，现有约7 500万慢性乙型肝炎患者及1 000万丙型肝炎患者。同时，受环境变迁、生活方式转变及饮食结构改变等因素影响，非病毒性肝病（如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病和药物性肝损伤）发病率持续攀升，严重威胁国民健康。
肝脏作为核心代谢的器官，在代谢废物和毒素降解过程中会大量产生超氧阴离子自由基、过氧化氢以及羟自由基等活性氧（ROS），这些物质主要来源于线粒体电子传递链、细胞色素P450及NADPH氧化酶系统。在正常生理条件下，这些ROS分子参与调控细胞信号转导和代谢过程；然而在病理状态下，ROS过度累积会引发氧化应激，导致脂质、蛋白质及DNA损伤，进而驱动肝损伤进展。
大量研究表明，补充高效天然抗氧化剂可有效清除自由基、调节氧化还原平衡，对疾病预防与健康提升具有重要意义。其中，食源性蛋白肽因具备易吸收、低致敏性和多样生物活性等特点，已成为功能性食品开发的理想组分。目前，多种动植物（如鱼类、乳类、亚麻籽等）来源的抗氧化肽已在食品与药品领域广泛应用。牦牛乳作为高营养价值乳源，其必需氨基酸与非必需氨基酸的组成比例均明显优于普通畜乳。酪蛋白约占牦牛乳总蛋白的80%，除具备卓越的乳化稳定性和起泡特性外，还因其独特的酶解敏感性，可通过蛋白水解作用释放多种功能活性肽段，包括阿片肽、血管紧张素转换酶抑制肽、免疫调节肽及抗氧化肽等，展现出治疗潜力。
尽管一些研究已证实，牦牛乳酪蛋白酶解多肽具有显著的化学抗氧化能力及对非肝细胞模型（巨噬细胞、血管内皮细胞）的保护作用，但其能否直接保护肝细胞抵御氧化应激损伤仍缺乏实验证据。这一关键问题严重限制了酪蛋白肽在肝病干预中的应用转化。因此，兰州理工大学生命科学与工程学院的杨淑红、李敏倩、边亚琴等采用单酶/复酶组合策略酶解牦牛乳酪蛋白获得不同酶解多肽溶液，以2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）阳离子自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力及AML12小鼠肝实质细胞氧化应激损伤细胞存活率为初筛指标，优选抗氧化活性多肽；通过DEAE-52纤维素柱层析与Sephadex G50凝胶层析分级纯化抗氧化多肽组分；系统评价多肽组分对AML12细胞内ROS、过氧化产物丙二醛（MDA）、NO及炎症因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）分泌的调控效应，以期揭示酪蛋白酶解多肽对肝细胞氧化损伤的直接保护机制，为其在肝病治疗产品开发中的转化应用提供理论支撑。
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酪蛋白酶解多肽自由基清除能力分析
选用5 种蛋白酶进行排列组合进行酶解，由于中性蛋白酶与碱性蛋白酶均能够水解疏水性氨基酸，且中性蛋白酶酶解位点更广泛，几乎覆盖碱性酶所有位点，因此在双酶和三酶组合时剔除了包含碱性蛋白酶的组合，按照蛋白酶酶解活性的最佳pH值从高到低的顺序进行酶解，共得到15 种酶解多肽。单酶酶解多肽分别为中性蛋白酶解多肽、木瓜蛋白酶解多肽、碱性蛋白酶解多肽、胃蛋白酶解多肽、胰蛋白酶解多肽；复合双酶酶解多肽有6 种：中木双酶解多肽、木胃双酶解多肽、中胃双酶解多肽、胰胃双酶解多肽、胰木双酶解多肽、胰中双酶解多肽；复合三酶酶解多肽有4 种：胰木胃三酶解多肽、中木胃三酶解多肽、胰中胃三酶解多肽、胰中木三酶解多肽。
将不同种类的酪蛋白酶解多肽样品用水稀释20 倍，采用DPPH法与ABTS法测定各多肽样品的自由基清除能力。如表2所示，胰木胃三酶解多肽的DPPH自由基清除率最高，为（42.50±2.48）%，其ABTS阳离子自由基清除率为（84.62±5.99）%；而中胃双酶解多肽的自由基清除率总体最低，分别为（21.97±0.60）%、（38.94±5.13）%。相比于单一蛋白酶解产物，混合酶解酪蛋白多肽的自由基清除能力普遍升高，这与已有报道一致。实验数据表明，中性蛋白酶解多肽的ABTS阳离子自由基清除能力较高，推测可能是中性蛋白酶的切割位点为苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等疏水性氨基酸的氨基端或羧基端肽键，会释放出大量疏水性氨基酸的短肽，这些短肽富含强大的电子供体和氢供体，可以有效清除ABTS阳离子自由基，因此具有较高的抗氧化活性。
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酪蛋白酶解多肽对AML12细胞氧化应激损伤的保护作用
细胞活性水平可以直观反映细胞的生理状态，因此，通过测定氧化应激条件下AML12肝细胞的存活率，进而评价多肽的潜在保护作用。H2O2能够直接氧化生物大分子（如脂质和蛋白质），促进自由基的大量积累，进而引发细胞损伤甚至死亡。因此，选用H2O2建立AML12细胞氧化应激损伤模型。如图1所示，H2O2氧化损伤AML12细胞的IC50为387 µmol/L。与氧化损伤组相比，谷胱甘肽组细胞存活率提高了83.48%，中性单酶解、胰木双酶解和胰中胃三酶解多肽组（均稀释至20 倍）的细胞存活率分别显著提高至69.38%（P＜0.000 1）、65.95%（P＜0.000 1）、63.32%（P＜0.01）。因此选择中性单酶解、胰木双酶解和胰中胃三酶解多肽进行后续实验。
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DEAE-52纤维素柱层析分离多肽组分的抗氧化应激损伤能力
DEAE-52纤维素柱色谱法主要用于分离纯化多糖，多肽，核苷酸和酶。经过酶解的酪蛋白多肽因为含有不同电荷，可以与DEAE-52纤维素交换材料相互作用而被交换吸附，再被不同浓度的NaCl溶液洗脱，从而达到分离的目的。如图2A～C所示，经不同浓度NaCl溶液洗脱得中性单酶解多肽含有4 个组分，按洗脱顺序命名为Z1、Z2、Z3和Z4；胰木双酶解多肽有3 个组分，按洗脱顺序命名为YM1、YM2和YM3；胰中胃三酶解多肽有3 个组分，按洗脱顺序命名为YZW1、YZW2和YZW3。
将分离得到的10 个多肽组分经过透析除盐、冷冻干燥后配制成不同质量浓度的水溶液，利用MTT法检测AML12细胞毒性作用，如图2D、E所示，50～200 µg/mL多肽水溶液对细胞无明显毒性。因此，选取200 µg/mL进行AML12细胞氧化应激损伤实验。如图2F所示，与氧化损伤组相比，中性单酶解多肽Z1、Z2、Z3和Z4分离组分均表现出明显的抗氧化应激损伤作用，其中Z3的保护作用最强，其细胞存活率达到83.32%。胰木双酶解多肽YM1和YM2分离组分对AML12细胞无抗氧化应激损伤作用，而YM3表现出明显的抗氧化应激损伤作用，其细胞存活率达72.31%。胰中胃三酶解多肽YZW1和YZW3组分也表现出显著的抗氧化应激损伤作用，其细胞存活率分别为76.33%和77.18%。
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Sephadex G-50凝胶层析分离多肽组分的抗氧化应激损伤能力
基于分子质量差异选用Sephadex G-50凝胶层析对样品进行分离，进一步纯化具有抗氧化活性的多肽组分。如图3A～G所示，Z1分离得到3 种组分，按洗脱顺序命名为Z1-A、Z1-B和Z1-C；Z2分离得到2 种组分，按洗脱顺序命名为Z2-A和Z2-B；Z3分离得到2 种组分，按洗脱顺序命名为Z3-A和Z3-B；Z4分离得到2 种组分，按洗脱顺序命名为Z4-A和Z4-B；YM3分离得到2 种组分，按洗脱顺序命名为YM3-A和YM3-B；YZW1分离得到3 种组分，按洗脱顺序命名为YZW1-A、YZW1-B和YZW1-C；YZW3分离得到2 种组分，按洗脱顺序命名为YZW3-A和YZW3-B。
将Sephadex G-50凝胶层析分离所得的多肽组分经冷冻干燥后配制成不同质量浓度的水溶液，采用MTT法检测AML12细胞毒性作用。如图3H、I所示，25～100 µg/mL多肽溶液对细胞无明显毒性。因此，选取100 µg/mL进行AML12细胞氧化应激损伤实验。如图3J所示，与氧化损伤组相比，Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B和YZW3-B共5 种多肽组分表现出极其显著的抗氧化应激损伤作用（ P ＜0.000 1），其细胞活力分别为72.20%、74.45%、74.60%、75.11%、82.19%。
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酪蛋白抗氧化肽对AML12细胞MDA、NO、IL-1β及TNF-α水平的影响
为阐明酪蛋白衍生抗氧化肽对H 2 O 2 所致AML12细胞损伤的保护机制是否涉及ROS调控，本研究通过DCFHDA荧光标记技术定量分析细胞内ROS含量变化。当ROS过量积累时，细胞的抗氧化系统无法有效调节，进而诱发氧化应激，造成显著的氧化性细胞损伤 。DCFH-DA本身不具备荧光特性，经细胞内水解酶作用生成二氯二氢荧光素后，可被ROS氧化为荧光物质二氯荧光素，进而会发出绿色荧光 。如图4所示，空白对照组细胞ROS含量很低，加入H 2 O 2 后AML12细胞产生了大量的ROS，再加入Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B、YZW3-B抗氧化多肽组分后，细胞内绿色荧光强度出现不同程度的减弱（ P ＜0.05、 P ＜0.01、 P ＜0.000 1），说明这些多肽组分能够显著降低细胞中的ROS含量。
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酪蛋白抗氧化肽对AML12细胞MDA、NO、IL-1β及TNF-α水平的影响
MDA作为脂质过氧化的标志性产物，其过量蓄积会破坏由磷脂双分子层和膜蛋白构成的生物膜系统，最终导致细胞膜通透性改变和结构完整性丧失。因此，检测MDA水平可以评估机体脂质过氧化的程度，进而间接反映细胞的氧化应激损伤程度。将Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B和YZW3-B抗氧化多肽分别与AML12细胞共同培养，收集细胞进行脂质过氧化物含量测定，结果如图5A所示。与空白对照组相比，5 种抗氧化多肽组分都能显著降低AML12细胞的MDA浓度（P＜0.01、P＜0.000 1）。
炎症是机体针对病原体、理化刺激或组织损伤所触发的一种免疫防御反应。当细胞内ROS水平升高时，会激活炎症信号通路，促使受损细胞大量分泌促炎介质（如NO、TNF-α和IL-1β等），引起周围细胞的炎症反应，进一步导致组织损伤 。因此，通过测定细胞培养上清液的促炎介质和炎症因子表达水平，能够有效评估细胞的炎症反应程度。如图5B～D所示，H 2 O 2 处理AML12细胞后其培养液中NO、TNF-α和IL-1β水平急剧升高，说明H 2 O 2 诱发了AML12细胞的炎症反应，加入多肽组分后，NO、TNF-α和IL-1β水平均出现明显下降。综上，酪蛋白抗氧化多肽能够抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和炎症发生标志物NO的表达，改善H 2 O 2 诱导AML12细胞的炎症反应。
结 论
本研究聚焦牦牛乳酪蛋白酶解多肽的抗肝细胞氧化应激损伤作用，通过系统分析不同酶解产物的自由基清除能力及对H2O2诱导AML12肝实质细胞应激损伤的保护效应，发现中性蛋白酶解、胰木双酶解及胰中胃三酶解多肽溶液（20 倍稀释）不仅能够显著清除DPPH自由基、ABTS阳离子自由基，且在H2O2刺激下能将AML12细胞活力分别提升至69.38%、65.95%与63.32%。经DEAE-52纤维素柱层析与Sephadex G-50凝胶层析分级纯化，筛选出5 种高效抗氧化多肽组分：Z1-C、Z3-B、YM3-B、YZW1-B及YZW3-B。通过荧光显微成像及ELISA检测，发现上述5 种多肽组分可明显降低肝细胞氧化损伤标志物（ROS、MDA及NO）和炎症因子（TNF-α、IL-1β）水平，证明牦牛乳酪蛋白多肽通过双重调控氧化应激与炎症信号，展现出显著的肝细胞保护活性。本研究系统揭示了牦牛乳酪蛋白酶解多肽抗肝细胞氧化应激损伤的作用机制，可为开发靶向肝病干预的牦牛乳多肽功能食品提供理论支撑，对推动牦牛乳资源高值化利用具有实践意义。
引文格式：
杨淑红, 李敏倩, 边亚琴, 等. 牦牛乳酪蛋白抗氧化肽的筛选及对肝细胞氧化应激损伤的保护作用[J]. 食品科学, 2026, 47(2): 104-112. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250715-119.
YANG Shuhong, LI Minqian, BIAN Yaqin, et al. Screening of antioxidant peptides from yak milk casein and their protective effects against oxidative stress injury in hepatocytes[J]. Food Science, 2026, 47(2): 104-112. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250715-119.
实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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