Highlights

  • 系统地综述了蛋蛋白质-多糖纳米复合物

  • 介绍了驱动纳米复合物行为的胶体和分子相互作用

  • 介绍了由不同生物聚合物制备的各种纳米复合物的特点

  • 概述了将姜黄素装入纳米复合物的封装机制

  • 分享了在功能食品中提供姜黄素的未来方向的观点

Introduction

作为一种草药和传统药物，姜黄被用作治疗关节炎、癌症、伤口愈合、伤口清洁、驱虫、消化系统疾病，甚至加强身体的能量。 姜黄素是从 Curcuma longa L.和 Curcuma spp.的根茎中提取的，占姜黄化合物的2%～8%，被认为是黄色/金色的主要原因和姜黄的主要功能化合物。 商业姜黄素是姜黄素和其他两种相关化合物的混合物，即脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素（图1A）。 姜黄素通常被用作着色剂和食品添加剂，世界卫生组织（WHO）规定的每日可接受摄入量（ADI）为0～3 mg/kg。 由于其固有的低毒性和各种特性，姜黄素在广泛的药理学发展中拥有巨大的潜力和应用，包括抗氧化剂、抗炎剂、抗菌剂和抗癌剂。 姜黄素在酸性和中性pH值下几乎不溶于冷水，但可溶于某些有机溶剂，如乙醇、丙酮和氯仿，也可溶于碱（pH值大于12）或极酸的溶剂，如冰醋酸。 此外，姜黄素在推荐的储存条件下（-20 ℃）具有良好的稳定性。

图1 （A）姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素的化学结构；（B）蛋白质/多糖复合物的不同结构

食品纳米技术是一个新兴且快速增长的领域。通过在纳米范围内操纵和控制它们，为食品工业利用与生物材料的尺寸和结构有关的特性和现象提供了一系列全新的可能性和机会。食品衍生的生物材料，如蛋白质和多糖，基于其独特的生物相容性、生物降解性、营养成分、易于功能化和降低毒性，在开发姜黄素的纳米给药系统方面具有巨大潜力。无论是植物还是动物来源的蛋白质，都是由各种氨基酸组合而成的两亲生物聚合物，通过各种分子相互作用（如氢键、静电相互作用、疏水相互作用等）对生物活性化合物表现出很强的亲和力，使它们能够被广泛地用作传递系统。多糖是另一种重要的生物材料，大量存在于各种植物和动物中，通常具有高度的亲水性，由糖苷键连接各种单糖组成，通过各种分子相互作用提供官能团并增加对生物活性化合物的亲和力，其方式与蛋白质类似（如氢键、静电作用、疏水作用等）。由于各种多糖在各种条件下具有出色的稳定性，并且容易获得，各种多糖，如壳聚糖、海藻酸盐、果胶、纤维素、葡聚糖、豆溶性多糖、阿拉伯胶、卡拉胶等，已经被广泛研究用于生物活性化合物的封装。

最近，蛋白质-多糖纳米复合物获得了越来越多的关注，因为不同类型材料的复合物通常优于单一生物聚合物。 在这篇综述中，美国康涅狄格大学营养科学系的Jingyi Xue、Yangchao Luo*对过去几年利用不同的复合技术，如形成复合物或共轭物的单步骤或多步骤方法，来制备用于姜黄素递送的纳米复合物进行了总结和解释，并详细介绍了各种封装机制，如pH驱动和反溶剂方法。 此外，还总结和比较了使用不同类型的生物聚合物合成的纳米复合物的封装和输送效率。 最后，对目前姜黄素应用的限制和挑战进行了深入探讨。

络合技术

蛋白质和多糖之间的相互作用在姜黄素纳米给药系统的制备过程中起着重要作用。与蛋白质-多糖纳米复合物的形成有关的主要相互作用可分为两个不同的部分：1）非共价反应，如静电、氢和疏水相互作用；2）共价反应，如化学交联和美拉德反应。表1中总结了最新的蛋白质-多糖纳米复合物及其形成方法。

表1 最近用于姜黄素封装的蛋白质-多糖纳米复合物的总结

蛋白质-多糖纳米复合物

蛋白质-多糖纳米复合物可以很容易地通过静电作用形成。最常用的受控自组装方法是在适当的溶液条件下使蛋白质和多糖带有相反的电荷。这可以导致尺寸增加，但避免相分离。以BSA和果胶为模型，展示了蛋白质-多糖复合物的相图和结构转变。如图1B所示，有四个步骤可以形成不同结构的蛋白质-多糖复合物：1）单个可溶性分子；2）分子内可溶性复合物；3）分子间可溶性复合物形成的纳米级稳定复合物；4）分子间不可溶性复合物形成的聚集物。通过静电作用制造蛋白质-多糖复合物的方法可分为两种不同的方法：1）单步形成，即在指定的pH条件下，通过混合生物聚合物的水溶液形成纳米复合物；2）逐层组装（核壳结构），即独立形成纳米复合物的核心，然后再连续包覆其他生物聚合物。

蛋白质-多糖纳米偶联物

由于活性官能团的存在，如氨基、羧基和硫醇基，蛋白质和多糖在一定条件下可以通过化学作用进行共轭。蛋白质-多糖纳米复合物也可以通过各种化学键形成，其中最常见的包括化学交联和美拉德反应。

化学交联

在开发蛋白质-多糖纳米复合物的过程中，化学交联通常是在加入交联剂引发化学反应以架起两种生物聚合物的桥梁后发生的。根据反应范围（交联桥的长度），化学交联剂通常属于两类中的一类，即短程和长程化学桥。短程交联剂，如1-乙基-3-(3-二甲胺基)-碳二亚胺（EDC）、戊二醛（在一定浓度下）和京尼平，由于其相对低的毒性和高生物相容性而被普遍使用。在一项研究中，比较了由酪蛋白和各种多糖形成的纳米复合物的物理化学性质，并进一步用EDC和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）交联得到的纳米复合物，以提高其封装效率和模拟胃肠道（GI）条件下的稳定性。对于果胶包被的纳米复合物，在隔夜交联后观察到颗粒大小减少了20 nm，这归因于蛋白质和多糖之间的共价结合，从而形成了更紧凑的结构。此外，果胶的高度支化结构可以启动纳米复合物表面的松散附着，导致相对较大的流体力学直径，在形成共价键后可以减少。获得的果胶包被的纳米复合物在模拟胃肠液和长期储存过程中也表现出极大的稳定性，这表明交联提供了明显的改善。然而，当使用化学交联剂时，如戊二醛，最流行的、低成本和高交联效率的交联剂，在临床和生物应用中必须考虑到其在高浓度下的不良健康后果。

最近，京尼平（京尼平），一种从栀子果实中提取的聚糖，由于其低毒性和相对较高的生物相容性，作为一种绿色交联剂，已经引起了越来越多的关注。京尼平介导的交联已经被用来加强酪蛋白、乳清蛋白和基于壳聚糖的输送系统的胶体稳定性和结构完整性，用于输送疏水和亲水的生物活性化合物。事实证明，在不同的pH条件下，京尼平与某些生物聚合物（如壳聚糖）的交联机制是不同的。一般来说（图2A），在碱性条件下，京尼平在与壳聚糖交联之前会发生开环自聚，从而形成长链的交联桥。然而，在酸性或中性条件下，京尼平上的酯基的亲核取代作用增强，导致与壳聚糖形成二级酰胺，在酸性条件下制备的网络由短链的交联桥组成（图2B）。在最近的一项研究中，京尼平被用来稳定酪蛋白-壳聚糖纳米复合物，动态光散射（DLS）结果显示，交联后的颗粒大小从256 nm降至238 nm，同时PDI从0.201显著降低至0.076。获得的纳米复合物的表面电荷从32.9下降到24.7，这表明在京尼平介导的交联反应中消耗了一级胺。在稳定性测试中，由于位于纳米复合物表面的壳聚糖的去质子化，酪蛋白-壳聚糖纳米复合物在pH7.2时不能保持纳米球形结构。因此，壳聚糖和酪蛋白之间的静电相互作用被削弱，导致壳聚糖解离和粒径的增加。相反，在不同的条件下，交联的纳米复合物的粒径和PDI保持相当稳定，表明京尼平介导的共价键促进了纳米复合物的稳定，而没有形成更紧凑的结构。在所有使用的浓度下，交联的纳米复合物都没有观察到细胞活力的降低，这表明它们的低无毒性和高生物相容性。

图2 京尼平交联反应的示意图（A）；在中性或酸性条件下形成的京尼平聚合物桥（B）

美拉德共轭法

传统上，基于蛋白质的纳米颗粒很容易受到蛋白酶和热处理的影响，这可能导致生理过渡期的结构退化，并导致封装的生物活性化合物的降解或在到达理想部位之前过早释放。事实证明，通过美拉德反应制备的糖基化蛋白可用于抑制高离子强度或低pH条件下的蛋白质沉淀。美拉德反应是肽上的氨基与还原糖末端的羰基之间自然存在的缩合反应，可用于蛋白质和多糖的共轭。虽然主要的反应部位是赖氨酸上的ε-氨基，但其他基团（色氨酸的吲哚基、精氨酸的胍基和组氨酸的咪唑基）也可用于糖化，但程度较低。如图3所示，美拉德反应一般可分为3个阶段：初始阶段、中间阶段和最终阶段。美拉德介导的共轭反应通常是基于Amadori重排和形成席夫碱。尽管在潮湿和干燥的条件下都能形成共轭物，但糖化速率受水存在的影响很大。因此，用于形成纳米复合物的蛋白质-多糖的共轭物通常是通过加热冻干的粉末混合物制备的，以控制最终产品。有研究利用BSA和葡聚糖在不同条件下形成的美拉德共轭物制备纳米复合物。结果显示，当葡聚糖不与BSA共轭时，形成了大小约为884 nm的大颗粒，表明自由葡聚糖不能避免BSA的聚集。然而，当美拉德反应时间从1 h增加到24 h时，所制备的纳米复合物的颗粒大小从887 nm下降到51 nm，表明BSA可以被亲水性葡聚糖的较高共轭度的共轭物所稳定。在不同的pH条件下，所获得的纳米复合物的稳定性明显增强，因为由BSA-葡聚糖共轭物制备的纳米复合物（24 h）有能力在pH 2和pH 7之间保持其结构和尺寸。同样的纳米复合物表现出良好的储存稳定性，因为尺寸在30 d内没有变化。在另一项研究中，BSA与功能化的淀粉（BSA-SF20）通过美拉德反应在60 °C和79%的相对湿度下被共轭。在加热过程和轻度搅拌的帮助下，得到的共轭物可以自组装成纳米凝胶，粒径约为90 nm，PDI约为0.24，这比单独的BSA对照（232 nm；PDI 0.41）明显更小、更均匀。BSA-SF20的Zeta电位为-24.4 mV，明显高于BSA单独对照（-18.6 mV）。已知功能化直链淀粉的Zeta电位为-24.5 mV，这证实了多糖外壳对蛋白质核心的有效覆盖。这种较高的Zeta-电位绝对值表明形成了稳定的纳米凝胶，这一点从PDI值从0.41降到0.24得到证实。多糖在纳米凝胶表面的共轭提供了一个立体屏障，避免了较大的异质性纳米凝胶的形成，这一点从BSA-SF20的狭窄尺寸分布得到了验证，而BSA控制的纳米凝胶则呈双峰分布。此外，体外胃肠道稳定性测试显示，35%的BSA-SF20纳米凝胶在300 min的消化后仍然没有受到伤害，而BSA对照组则不到5%。总而言之，通过美拉德反应的糖基化作用，蛋白质的稳定性得到明显改善，从而扩大了在各个领域的实际应用。

图3 美拉德反应示意图

封装机制

抗溶剂方法

有多种机制可用于将生物活性分子封装到静电蛋白-多糖纳米复合物中，其中最简单的是通过核心聚合物与生物活性分子的脱溶进行物理封装，或通过将其与蛋白质和多糖混合，然后加热处理，通过热凝结过程形成稳定的纳米复合物。抗溶剂方法可分为以下步骤：1）化合物的日晒，2）产生过饱和度，3）成核，4）核的后续生长。更具体地说，姜黄素首先溶解在一种溶剂（乙醇）中，随后将该混合物加入到一种溶剂混合的反溶剂（水）中。姜黄素在溶剂/反溶剂溶液中的溶解度低于在溶剂（乙醇）中的溶解度，这就产生了一种沉淀的驱动力，称为过饱和度。过饱和的产生是后续成核的先决条件，只有当过饱和度达到一定值，超过溶剂/反溶剂混合物中的溶解度时，才会发生成核（图4A）。初始成核后，姜黄素核不断增长，游离姜黄素的浓度不断下降。这种生长将持续到姜黄素的浓度达到平衡浓度（图4A）。如表1所总结的，抗溶剂法已被广泛用于姜黄素的封装，因为它易于操作和控制，使用起来相对安全。

pH值驱动方法

最近，pH值驱动法在将姜黄素封装到各种生物聚合物纳米复合物中引起了越来越多的关注，主要原因是其成本相对较低，而且避免了有机溶剂。其基本机制在图4B中说明。作为一种多酚类生物活性化合物，姜黄素中的羟基可以在强碱性溶液中被去质子化，并在水溶液中溶解。然后，溶解的姜黄素可以在超声和氢气作用的帮助下与生物聚合物合作。中和后，姜黄素中的酚基可以再次被质子化，因此姜黄素开始重新结晶，这可能发生在共同溶解的生物聚合物基质内或通过非共价键在生物聚合物链的表面发生。pH驱动法的程序可以大致分为4个步骤：1）姜黄素的溶解（姜黄素的去质子化）；2）引入生物聚合物基质；3）纳米姜黄素的重结晶（姜黄素的质子化）；4）去除未包被的姜黄素。有研究比较了脱溶法和pH驱动法将姜黄素封装到疏水改性的植物糖原纳米复合物中的效率。研究结果表明，通过脱溶法装载的姜黄素的封装效率低于15%，而pH驱动法的效率高达60%。

图4 抗溶剂负载法（A）的过饱和度、成核和后续增长示意图以及pH驱动负载方法（B）的机理

Protein-polysaccharide nanocomplexes as nanocarriers for delivery of curcumin: a comprehensive review on preparation methods and encapsulation mechanisms

Jingyi Xue, Yangchao Luo*

Department of Nutritional Sciences, University of Connecticut, Storrs, CT 06269, USA

*Corresponding author.

E-mail address: yangchao.luo@uconn.edu

Abstract

Curcumin, commonly used as a coloring agent as well as food additive, has exhibited great therapeutic efficacy for development of functional foods. In order to expand its applications in food, strategies are needed to tackle the poor water-solubility, bioavailability and bioaccessibility of curcumin. Nanoparticles made from individual biomaterials such as proteins, polysaccharides and lipids have been introduced and their properties have been comprehensively studied. Recently, there has been an increasing interest in nanocomplexes made from two or more biomaterials because of their ability to composite the advantages of various components. This review has specific focus on the nanocomplexes fabricated from proteins and polysaccharides. First, complexation methods with or without chemical covalent bond formation are summarized, while different methods with different degrees of complexation are discussed. The encapsulation strategies of curcumin, both traditional and newly invented, are also compared. Then, the structure and physicochemical properties of the resulting binary or ternary nanocomplexes are discussed in detail, as well as a comparison of the delivery efficiency. Last but not least, the current limitations and future directions in the development of curcumin-loaded biopolymer nanoparticles for the design of future food products are presented.

Reference:

XUE J Y, LUO Y C. Protein-polysaccharide nanocomplexes as nanocarriers for delivery of curcumin: a comprehensive review on preparation methods and encapsulation mechanisms[J]. Journal of Future Foods, 2023, 3(2): 99-114. DOI:10.1016/j.jfutfo.2022.12.002.

翻译/编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

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Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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