17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）是一种能够促进动物生长、提高奶牛产奶量的甾体雌激素，毒理学实验表明，即使低浓度的E2残留物通过食物链进入生物体，也会干扰正常的内分泌功能，造成有害影响。碳量子点（CQDs）作为一种新兴荧光碳纳米材料，已被广泛用于构建荧光传感器对环境和食品中的有害物质进行检测。荧光猝灭剂金纳米粒子（AuNPs）凭借其易于控制的粒径大小、良好的生物相容性和优异的荧光猝灭能力而广泛用于光学和生物传感器之中。
华南理工大学食品科学与工程学院的韦庆益、林轩然、蒲洪彬*等人将CQDs与AuNPs结合，利用FRET效应构建一种荧光适体传感器用于E2的检测。首先通过酰胺反应将E2的短链适配体P1连接在CQDs上，AuNPs加入后适配体会与AuNPs靠近，从而触发CQDs与AuNPs间的FRET效应，导致CQDs的荧光猝灭。当加入目标物E2后，适配体P1与E2间更强烈的亲和力使P1从AuNPs表面脱离，CQDs的荧光得以恢复，并以此建立荧光恢复强度与E2浓度的线性关系，达到定量检测E2的目的。此外该荧光短链适体传感器对牛奶和环境水样中的E2进行检测，其结果与HPLC方法结果一致，以证明该传感器在实际应用中的潜力。
1基于AuNPs的荧光适体传感器检测E2的原理
AuNPs是一种消光系数高、具有拉曼增强特性且尺寸容易控制的金属纳米材料，还是一种优良的荧光猝灭剂，在光学传感中有着出色的表现。因此本实验利用AuNPs的荧光猝灭作用建立了一种灵敏、准确、快捷的荧光适体传感器。其检测原理如图1所示，首先利用酰胺反应在CQDs上连接E2的短链适配体P1，形成CQDs-P1，然后通过柠檬酸盐还原法合成了酒红色的AuNPs，当在离心管中加入这二者时，由于适配体碱基间的金属配位作用，AuNPs对适配体具有较强的吸附亲和力，CQDs-P1会吸附在AuNPs表面，而CQDs的荧光发射光谱与AuNPs的紫外吸收光谱有较大的重叠，当它们相互靠近时且CQDs与AuNPs的距离在10 nm以内时，处于激发态的CQDs就会将能量转移至处于基态的猝灭剂AuNPs，即FERT效应，表现为CQDs的荧光被猝灭；当目标物E2加入溶液体系后，适配体P1更倾向于与E2结合从而离开AuNPs表面，缺乏近距离这一条件后FRET不再发生，CQDs的荧光得以恢复，因此可以通过建立E2浓度与荧光恢复程度的线性关系达到定量检测E2的目的。
2CQDs的表征
通过微波辅助水热法快速合成荧光CQDs，其形貌特征通过透射电子显微镜图像进行观察。如图2A所示，CQDs外观接近球形并且在溶液中分散均匀，其粒径在2.0～6.0 nm之间，平均值在3.5 nm左右。CQDs的紫外和荧光性能如图2B所示，可以观察到CQDs的最佳荧光激发波长和发射波长分别位于350 nm和442 nm，并且由于芳香族C＝C键的π-π*跃迁和C＝O键的n-π*跃迁，CQDs的UV-Vis光谱在239 nm和346 nm处分别有一个吸收峰。图2B右上角的插图显示了合成的CQDs在自然光下呈现浅黄色（左），在365 nm的紫外灯照射下会发出明亮的蓝色荧光（右），表明制备的CQDs具有良好的荧光性能。此外，利用FTIR光谱对CQDs表面的官能团进行研究，结果如图2C所示，很明显在3250 cm-1附近出现了一个强宽峰，这归因于O—H和N—H的伸缩振动，另外在1 683 cm-1和1257 cm-1观察到的两个吸收峰分别是由C—O和C—N的伸缩振动引起，在1544 cm-1和1378 cm-1出现的吸收峰分别是N—H和—CH2的变形振动导致，最后在1186、1072 cm-1和992 cm-1处观察到的弱吸收峰是由C—OH的伸缩振动引起。
3CQDs-P1的表征
通过UV-Vis光谱表征E2短链适配体P1在CQDs上的连接，如图3A所示，单独的P1由于其碱基在260 nm观察到明显的紫外吸收峰，单独的CQDs在346 nm和249 nm两个位置出现了紫外吸收峰，而连接了P1的CQDs同时在346 nm和260 nm左右出现了归属于P1和CQDs的紫外吸收峰，初步证明了CQDs-P1的形成。图3B是琼脂糖凝胶电泳的实验结果，泳道1是CQDs，在紫外灯的照射下观察不到DNA条带的存在，泳道2是适配体P1，可以看见清晰明亮的DNA条带出现，泳道3代表与CQDs反应后的P1，由于连接了CQDs，P1的迁移率降低，导致其条带明显落后泳道2，其下方的另外一条条带应该是多余的未连接的P1，该结果更为有力地证明了CQDs-P1的成功合成。
4AuNPs的表征
从图4A可以看出，加入700 μL柠檬酸盐还原出的AuNPs呈现近圆形，粒径在30～40 nm范围内，与理论计算值相近，但大小均匀性不是很好，这可能是一步还原法的不足之处。图4B中展示了所合成的AuNPs在527 nm处由于Au的表面等离子体共振所引起的宽紫外吸收带，可以观察到它和CQDs的荧光发射光谱有较大面积的重合，符合FRET发生的条件之一，右上角的插图是AuNPs的图片，可以看到AuNPs在自然光下呈现粉紫色，以上结果证明了AuNPs的成功合成和AuNPs作为优良荧光猝灭剂的潜力。
5E2检测的可行性分析及检测条件优化
5.1可行性分析
如图5所示，CQDs-P1表示100 μL CQDs-P1与400 μL PB混合均匀后测试得到的荧光光谱，其荧光强度最高；CQDs-P1＋AuNPs表示200 μL AuNPs与200 μL PB加入到100 μLCQDs-P1溶液中，然后轻柔振荡20 min后测试得到的荧光光谱，可以看出其荧光强度明显降低，证明CQDs的荧光确实能被AuNPs有效猝灭；CQDs-P1＋AuNPs＋E2则表示200μL AuNPs与100 μL PB加入到100 μL CQDs-P1溶液中轻柔振荡20 min，再加入100 μL 10 -6 mol/L E2孵育60 min后测试得到的荧光光谱，相较于被猝灭的荧光强度，能观察到加入E2后其荧光有明显的恢复，证明E2与其适配体结合并将其带离了AuNPs表面，使得CQDs荧光恢复。由此可知，将该荧光适体传感器用于E2的检测可行。
5.2AuNPs粒径优化
如图6A所示，随着Tc溶液添加量从500 μL增加到900 μL，还原得到的AuNPs其表面等离子体共振峰位置从531 nm逐渐蓝移至522 nm，通过紫外峰位置与AuNPs粒径的关系换算得知其粒径分别为50、42、39、32、15 nm，右上角的插图显示了随着粒径的减小（Tc溶液添加量的增加），AuNPs溶液的颜色逐渐由紫红色转变成亮酒红色。随后将合成的不同粒径的AuNPs溶液用于猝灭CQDs的荧光，结果如图6B所示，在AuNPs加入体积固定为100 μL的前提下，不同粒径的AuNPs对CODs荧光的猝灭效率相差不大，都能猝灭CQDs 30%左右的荧光，39 nm的AuNPs表现出最佳的荧光猝灭效率，可能是因为这个粒径大小的AuNPs在溶液中比较稳定，并且适合吸附大量的CQDs-P1，因此AuNPs的粒径优化为39 nm。根据紫外吸光度与该粒径大小的AuNP浓度关系换算得到，合成并浓缩5倍后39 nm的AuNP浓度大约为 4.57×10 -10 mol/L。
5.3AuNPs添加体积和猝灭时间优化
在AuNPs粒径优化为39 nm的基础上，进一步对AuNPs的添加体积和猝灭时间进行优化。在CQDs-P1的溶液中分别加入100、150、200、250、300 μL的AuNPs溶液进行荧光猝灭实验，结果如图7A所示，随着AuNPs溶液的添加体积从100 μL增加到200 μL，CQDs的荧光猝灭程度逐渐增加，而当AuNPs溶液的添加体积进一步增加时，CQDs的荧光猝灭程度却在逐渐降低，这可能是因为溶液体系中AuNPs浓度较大，容易发生聚集，导致AuNPs沉降，进而影响到其对CQDs荧光的猝灭，因此AuNPs的添加体积优选为200 μL。图7B是200 μL浓度约为4.57×10 -10 mol/L的AuNPs加入到CQDs-P1溶液中不同时间后对CQDs荧光的猝灭效率，可以看到随着时间的延长，AuNPs对CQDs荧光的猝灭效率越来越高，说明越来越多的CQDs-P1吸附到AuNPs上，荧光猝灭效率在20 min之后达到平稳，此时应该已经达到吸附饱和状态，因此AuNPs对CQDs的猝灭时间优化为20 min。
5.4 E2与P1孵育时间优化
图8是E2与CQDs-P1/AuNPs溶液体系分别孵育15、30、45、60、75、90 min后的相对荧光强度（F－F0，F0为CQDs荧光被AuNPs猝灭后的荧光强度，F为猝灭后再加入E2的荧光强度），即荧光的恢复程度，随着孵育时间的延长，体系的F－F0越来越高，表明越来越多的P1与E2结合并不再吸附在AuNPs表面，从而引起CQDs荧光的恢复，体系的F－F0在60 min后趋于稳定，表明此时E2能结合的P1达到了最大值。因此荧光的恢复时间优化为60 min。
6荧光适体传感器检测E2的灵敏度测试
如图9A所示，CQDs-P1溶液具有最高的荧光强度，加入AuNPs后其荧光被大幅度猝灭（F0），随着加入E2浓度的增大，CQDs的荧光强度逐渐恢复的越来越高（F），可以观察到E2最终浓度低至2×10-10 mol/L时几乎就起不到恢复CQDs荧光的作用了。以E2最终浓度（2×10-9～2×10-5 mol/L）的对数值为横坐标，对应的相对荧光强度为纵坐标绘制标准曲线（图9B），拟合得到线性方程y=58.50x＋558.95，决定系数R2为0.992。在此基础上，计算出该荧光适体传感器测定E2的LOD为3.4×10-10mol/L，LOQ为1.0×10-9mol/L。结果表明，该传感器对痕量E2的定量检测具有宽广的检测范围和较高的灵敏度。
7荧光适体传感器检测E2的特异性及重复性测试
如图10A所示，可以看出CQDs荧光被AuNPs猝灭后，只有加入E2或者将E2连同干扰物一起加入才能引起荧光大幅度的恢复，而单独加入上述干扰物质几乎不会引起荧光强度的变化，表明适配体只会特异性地与E2结合从而恢复CQDs的荧光，该结果证明了所构建的荧光适体传感器在检测E2时具有良好的选择性。另一方面，为了研究该荧光适体传感器用于E2检测的重复性，制备了10组E2最终浓度为2×10-7 mol/L的平行样品用于实验，其对应的相对荧光强度F－F0如图10B所示，可以看出这10组平行样品的荧光恢复程度接近，计算其F－F0的相对标准偏差（RSD）为5.0%，说明该荧光适体传感器对E2 的检测同样具有良好的重复性。
8实际样品中E2的检测
该研究选择牛奶、湖水和实验室自来水作为实际样品对E2进行加标检测，将其按照1.3.6节经过简单的预处理后制备成E2的加标溶液，然后与CQDs-P1和AuNPs的混合溶液孵育60 min后进行荧光测试，其中E2的加标终质量浓度为1、2.5、5 μg/mL。另外也对未添加E2的牛奶和水样进行了检测，将其作为对照结果。表1显示在对照中未检测到E2的存在，原因可能是所选取的牛奶和水样中E2的浓度低于该适体传感器的检出限；此外，不同E2加标质量浓度的牛奶样品获得的回收率为89.67%～108.66%；HPLC方法检测实际样品中的E2得到的回收率在81.53%～115.44%之间，RSD为0.6%～9.4%。从结果可以得出该荧光适体传感器的检测结果与HPLC方法得到的检测结果较为一致，表明该荧光适体传感器在监测实际样品中E2的含量时具有良好的准确度和精度，并且有望作为一种简便快捷的传感方法在现实场景中准确灵敏地检测痕量的E2残留。
结 语
利用AuNPs对CQDs荧光的猝灭作用建立了一种用于E2检测的荧光适体传感器，结果显示该传感器对E2具有宽广的检测范围（2×10-5～2×10-9mol/L），且LOD能达到3.4×10-10 mol/L，E2和其短链适配体的高亲和性赋予了该传感器良好的选择性，最后将其用于牛奶和湖水等实际样品中E2的检测，得到的回收率为89.67%～113.36%，RSD为1.4%～6.3%，其结果与HPLC方法检测E2得到的结果较为一致，表明该传感器具有实际的应用潜力。
本文《基于金纳米粒子的荧光适配体传感器检测食品中的17β-雌二醇》来源于《食品科学》2023年44卷第14期368-376页，作者：韦庆益，林轩然，张佩瑶，孙大文，蒲洪彬。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220630-340。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑；云南农业大学食品科技学院 李曦明；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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