《食品科学》：西华大学唐洁教授等：山苍子精油对白假丝酵母菌细胞膜屏障影响的机理|唐洁|山苍子精油|白假丝|细胞膜|西华大学|酵母菌|食品科学

白假丝酵母菌（Candida albicans）作为一种条件致病菌，常见于宿主的胃、肠道、口腔、皮肤和泌尿系统，其具有表型可塑性，以不同形态在营养菌丝和芽殖酵母间切换，使其能够定植并感染宿主从而引起疾病。白假丝酵母菌能够引起传统发酵蔬菜及奶制品腐败，从而引起食品安全风险。山苍子精油是一种高附加值产品，具有广泛的生物和药理活性，包括抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化作用等。其可作为食品调味剂使用，与食品基质作用，从而改善食物感官品质。有研究表明，山苍子精油及其活性化合物具有良好的抑菌活性，可广泛抑制食源性病源菌，延长食品保质期。

西华大学食品与生物工程学院的孙月、曾朝懿、唐洁*等选用山苍子精油作为天然抗菌剂，分析其主要活性成分，通过不同质量浓度的山苍子精油处理筛自“生花”泡菜中的白假丝酵母菌，观察处理前后白假丝酵母菌细胞形态、表面疏水性、表面电荷、胞内核酸和蛋白质泄漏变化情况，探究山苍子精油对白假丝酵母菌抗菌活性及其对细胞膜屏障影响的机理，以期为山苍子精油及其生物活性化合物在食品工业中应用提供理论参考。

山苍子精油主要活性成分

采用GC-MS对山苍子精油进行成分分析，所得分析谱图如图1所示，与NIST质谱标准品进行比对后的结果列于表1。

由图1可以得出，山苍子精油经GC-MS分析，共检测出90 种物质，如表1所示，其中(Z)-柠檬醛（13.28%）、柠檬醛（12.52%）、D-柠檬烯（12.45%）、甲基庚烯酮（7.13%）、芳樟醇（6.57%）、香茅醛（6.47%）含量较高。成分分析结果表明，山苍子精油主要成分为单萜类化合物及其氧化物，如D-柠檬烯、月桂烯、柠檬醛、芳樟醇等，总质量分数为59.0361%。有研究表明，D-柠檬烯、柠檬醛、芳樟醇具有抑菌杀菌的作用，在食品中可用作天然防腐保鲜剂。但也有研究者认为植物精油中存在的微量成分对抑菌活性的影响比植物精油中的主要成分更重要，主要成分与其他活性较弱的微量成分的组合可能会达到协同效应，这表明与植物精油的主要成分相比，植物精油的抗菌活性更强。

山苍子油对白假丝酵母菌的抗菌活性

通过二倍稀释法确定山苍子精油对白假丝酵母菌的最低抑菌浓度MIC为0.25 mg/mL，通过不同质量浓度山苍子精油处理后白假丝酵母菌的残菌数如图2A所示，确定最低杀菌浓度MFC为1 mg/mL。山苍子精油对白假丝酵母菌0～24 h的抗菌活性如图2B所示，阴性对照组白假丝酵母菌在8～24 h内生长状况良好，处于对数生长期。当山苍子精油质量浓度达到MIC（0.25 mg/mL）和MFC（1 mg/mL）时，则完全抑制白假丝酵母菌的生长。其中，在山苍子精油质量浓度为0.25 mg/mL条件下处理4 h，白假丝酵母菌生长已停滞。

山苍子精油对白假丝酵母菌的抑菌机制

3.1 山苍子精油作用前后白假丝酵母菌菌体微观形态分析

用扫描电子显微镜观察山苍子精油处理前后白假丝酵母菌的微观结构变化。如图3A所示，未经山苍子精油处理的白假丝酵母菌具有完整真菌的独特特征，边界光滑完整，呈椭圆形。与之相反，如图3B所示，经MIC-山苍子精油处理后的白假丝酵母菌呈下凹、扭曲、褶皱状。如图3C所示，当白假丝酵母菌暴露于MFC的山苍子精油时，细胞明显破裂，附着成团。结果表明，山苍子精油对白假丝酵母菌的细胞壁有明显的损伤作用，细胞形态发生改变，这些细胞结构的变化可能是由于膜的溶解和转化。

3.2山苍子精油对白假丝酵母菌细胞表面特性的影响

山苍子精油作用前后细胞表面电荷绝对值变化如图4所示，与对照组相比较，经MIC和MFC山苍子精油处理后，菌体表面电荷绝对值均有所减少。结果表明，当菌体暴露在一定量的山苍子精油中，其表面电荷会减少，使细胞更易聚沉、成团，从而影响菌体正常生长繁殖。

3.3山苍子精油对白假丝酵母菌细胞完整性的影响

如图5A所示，本研究中未经山苍子精油处理的白假丝酵母菌细胞发出明亮的绿色荧光，表明细胞膜完整；相反，如图5B所示，白假丝酵母菌经MIC山苍子精油处理后，绿色荧光强度明显减弱，红色荧光强度增强，表明部分细胞受到了损伤，而在未受损伤的细胞中，SYBR Green I的水解性受到了一定程度的抑制。白假丝酵母菌经MFC山苍子精油处理后，如图5C所示，几乎没有绿色荧光发射，表明几乎所有白假丝酵母菌的细胞膜都被破坏，致使细胞失活死亡。

3.4 电解质泄露情况分析结果

如图6所示，经MIC和MFC山苍子精油处理后的白假丝酵母菌细胞膜受到破坏，相对电导率明显高于对照组。这是因为电解质从细胞泄漏到测试液中，并且随山苍子精油的浓度从MIC到MFC的增加，菌体细胞质泄漏量升高。说明山苍子精油能够破坏菌体细胞膜结构，导致胞内电解质流出，致使细胞生长受到抑制或死亡。

3.5 胞内大分子泄露情况分析结果

山苍子精油处理后核酸和蛋白质泄漏情况如图7所示，与对照组相比，经MIC和MFC的山苍子精油处理后，如图7A和图7B所示，胞外菌液中核酸和蛋白质的泄漏量明显增加，其泄漏量与山苍子精油的质量浓度、处理时间成呈正相关。表明山苍子精油能够破坏菌体细胞膜，增加其通透性，造成胞内大分子物质流出，从而导致菌体死亡。

结论

本研究通过GC-MS组分分析鉴定出山苍子精油由90 种化合物组成，主要为单萜类化合物和单萜氧化物，其含量最高的化合物依次是(Z)-柠檬醛（13.28%）、柠檬醛（12.52%）、D-柠檬烯（12.45%）、甲基庚烯酮（7.13%）、芳樟醇（6.57%）、香茅醛（6.47%）。山苍子精油对白假丝酵母菌具有良好的抗菌活性，当山苍子精油质量浓度为0.25 mg/mL处理4 h时，白假丝酵母菌生长已停滞。通过扫描电子显微镜观察菌体的微观结构发现，山苍子精油处理白假丝酵母菌菌体后，后者细胞壁受损，细胞变形、萎缩，随着山苍子精油量的增加，对细胞膜的损伤作用增强。此外，山苍子精油处理后白假丝酵母菌细胞膜完整性被破坏，通透性增加，胞内离子动态失衡，大分子物质泄漏，导致白假丝酵母菌代谢紊乱，菌体裂解死亡。本研究初步探究了山苍子精油对白假丝酵母菌细胞膜屏障影响的机理，可为将山苍子精油添加在发酵蔬菜汁和奶制品中抑制白假丝酵母菌提供理论依据，并对评估山苍子精油及其生物活性化合物在食品加工与保存中的进一步研究开发利用具有一定的意义。

作者简介

通信作者：

唐洁，女，西华大学食品与生物工程学院教授、博士生导师、院长，中国食品科学技术学会高级会员、四川省第十届食品科学技术学会副理事长、四川省第三届食品安全专家委员会专委会副主任委员、四川省食品安全风险评估专家委员会委员、四川省微生物学会会员、四川省专家服务团专家、四川省机制体制改革项目专家库专家、四川省高等教育学会教育教学专家库专家，《Food Safety and Health》期刊共同主编。泰国易三仓大学兼职博导。近年来主持包括国家自然基金、四川省重点研发等省部级以上科研项目10余项，发表学术论文80余篇，获授权发明专利10余项，获科技成果9项，获中国轻工业联合会科学技术进步奖、成都市科技进步奖等。主持参与教育部产学协同育人项目、教育部新工科教学研究与实践改革项目、教育部新农科教学研究与实践改革项目、四川省教育教学改革重点项目等10余项，发表10余篇教研教改论文，获四川省优秀教学成果一等奖2项、三等奖1项。主要研究方向包括：农产品及环境中农药残留生物降解的机理及精准调控，传统发酵食品微生物种质资源挖掘、改造和利用，调味品发酵过程优化与控制。

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