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Abstract

鼠尾藻（Sargassum thunbergii）可用于提取低分子量多糖（LMPST），并通过体外实验评估其对脂质生成的抑制作用。实验从鼠尾藻中获得两种性质的LMPST，并评估其对棕榈酸（PA）诱导的HepG2和3T3-L1细胞脂质积累的影响。LMPST处理减少了上述PA处理细胞中的脂质沉积、细胞内游离脂肪酸及甘油三酯的浓度。机制研究表明，LMPST2显著抑制了脂肪生成，并在PA处理的3T3-L1细胞中激活了脂解途径。此外，在PA处理的HepG2细胞中，LMPST2显著提高了游离脂肪酸的氧化程度。来自鼠尾藻的LMPST2的有益特性，使其成为抑制细胞内脂质积累的潜在候选药物，并可作为某些病症的治疗剂。

Introduction

肥胖是一种类似于动脉粥样硬化和高血压的慢性疾病。血液和组织中能量摄取与利用之间的不平衡，使得多余的能量被积累在脂肪细胞中，这些细胞数量增加和/或大小增加，将会导致了这种肥胖的产生。高能量摄入和缺乏运动是导致肥胖发展的两个主要因素，这两者与脂肪细胞体积增大和过度脂质积累密切相关，同时，这也会导致脂肪组织中有害的激素分泌。许多早期研究已经报道了肥胖与代谢综合征之间的关联，并证明了减轻体质量可以改善各种与肥胖相关的并发症和代谢综合征。摄入抗肥胖药物是一种减轻体重的方法。先前开发的肥胖药物，如利拉鲁肽、托吡酯、奥利司他、洛卡塞林和丙酮醇已经获得食品和药物管理局的批准，但大多数合成抗肥胖药物会引起不良副作用，已经被禁止使用。因此，有必要填补开发治疗肥胖及其并发症的新药物的空白，这些药物应具有天然且无毒的特性。海洋生物是许多天然产物的来源，包括多糖、多酚和蛋白质。其中，从鼠尾藻合成的多糖因其良好的性质而受到增强的关注，因此鼠尾藻是开发新型抗肥胖药物的潜在候选物。此外，鼠尾藻中的低分子多糖已有大规模的生物学研究。到目前为止，由于大多数研究集中于鼠尾藻多糖，而鼠尾藻低分子量多糖的结构和生物学性质的研究则相对较少，本研究对三叶藻（LMPST）的低分子量多糖进行了扫描电子显微镜（SEM）、傅立叶变换红外（FTIR）和多角度光散射（MALS）分析，进一步的，通过使用棕榈酸（PA）处理的3T3-L1和HepG2细胞评估其对细胞内脂肪积累的抑制作用，此外，通过Western blotting分析其在体外对脂肪生成、脂肪分解和游离脂肪酸氧化途径的作用机制。综合来看，本研究结果有望为LMPST作为天然抗肥胖剂在功能食品和食品工业领域的实际应用提供实用性的参考。

Results

低分子多糖的纯化及其化学组成以及通过SEM、FTIR和MALS分析的LMPST2的物理特性

如图1A所示，Sephacryl S-400谱显示STCF3可分离成两个LMPST。使用SEM进行了显微观察分析LMPST的物理特性。在图1B中，STC呈现粗糙和不规则的表面形态，而STCF3和LMPST则呈圆形、形状规则。使用了FTIR光谱研究纯化LMPST的功能基团，图1C显示了LMPST的FTIR光谱。在1078 cm-1和1404 cm-1处检测到的峰表示C-O-C糖苷键的反对称拉伸带和C-OH弯曲振动，而在1644～1650 cm-1处检测到的峰表示葡聚糖中存在C=O。MALS被纳入以评估平均摩尔质量，LMPST1和LMPST2分别为6.001×105和5.925×103 g/mol（图1D）。这些结果表明，纯化LMPST的平均分子量明显降低，且通过Sephacryl S-400尺寸排阻色谱法，低分子量的LMPST2纯度得到提高。

STC、STCF3和LMPST对PA处理的3T3-L1细胞的脂质积累抑制作用

为了考虑STC、STCF3和LMPST对PA处理的3T3-L1细胞脂质抑制作用，对相同细胞进行了ORO染色以评估细胞毒性之前的影响。首先，使用对STC、STCF3和LMPST进行MTT检测，以确定是否对细胞具有毒性作用。图2A和B显示，STC、STCF3和LMPST在25、50和100 μg/mL浓度下均无细胞毒性，故这些浓度被用于进一步的研究。如图2C所示，ORO染色显示STC、STCF3和LMPST处理后，脂质的积累得到了高度抑制。接下来，我们旨在确定STC、STCF3和LMPST2是否降低PA处理的3T3-L1细胞中TG和FFA水平。与对照组相比，PA处理组的TG和FFA显著增加。同时，STC、STCF3和LMPST2处理后，TG和FFA水平显著下降。这些结果表明，STC、STCF3和LMPST2可以通过降低PA处理的3T3-L1细胞内 TG 和 FFA 含量减少脂质积累。

LMPST2对3T3-L1细胞脂肪生成和脂解相关蛋白表达水平的影响

为了澄清脂肪生成和脂解途径的机制，进行了Western blot分析以确定每种蛋白质表达水平。结果表明，在PA处理的3T3-L1细胞中，PPAR-γ和C/EBP-β的蛋白表达水平升高（图3）。然而，LMPST2显著抑制了PA处理的3T3-L1细胞中关键脂肪生成蛋白表达水平。与对照组和PA处理组相比，脂肪生成C/EBP-α的强度没有显著差异，但在高浓度LMPST2处理组中，蛋白质表达水平明显下降。在代谢性FGF-21水平的情况下，代谢调节剂在高浓度LMPST2处理组中显著提高。如图3C和D所示，PA诱导并不会影响对照组和PA处理组之间脂解ATGL的蛋白表达水平。LMPST2处理组中ATGL水平略有增加，而脂解p-HSL和p-AMPK水平在PA处理后显著降低。然而，p-HSL和p-AMPK蛋白表达水平在LMPST2处理后显著增加。这些结果表明，LMPST2可以有效调节关键的脂肪生成和脂解蛋白标记物，从而影响PA诱导作用。

STC、STCF3和LMPST对PA处理的HepG2细胞的脂质抑制作用

MTT实验显示，STC、STCF3和LMPST对HepG2细胞没有细胞毒性作用。PA处理显著增加了HepG2细胞内脂质的积累，而STC、STCF3和LMPST处理后脂质滴减少。图4C中定量显示了相对脂质积累。为了确定STC、STCF3和LMPST对细胞内脂质的抑制作用，测定了PA处理的HepG2细胞内的TG和FFA含量。结果显示，PA诱导显著增加了细胞内TG和FFA水平，使其超过对照组的两倍。相反，经过STC、STCF3和LMPST2处理后，HepG2细胞内TG和FFA水平显著降低。因此，可以得出结论，在STC、STCF3和LMPST2存在的情况下，肝细胞内的脂质积累明显减少，PA处理后细胞内TG和FFA含量也相应减少。

LMPST2调节PA处理的HepG2细胞中与脂肪酸氧化相关蛋白的表达水平

在本研究中，使用Western blotting检查了PPAR-α、CPT-1、p-ACC、p-AMPK和FGF-21这些与游离脂肪酸氧化相关的蛋白质。如图5所示，PA存在下，PPAR-α和p-AMPK蛋白表达水平降低，而在LMPST2处理后显著增加。另一方面，CPT-1和p-ACC的水平因PA处理显著增加，而LMPST2处理组相应指标也显著增加。代谢调节剂FGF-21水平受到PA处理显著下降。然而，LMPST2处理后，FGF-21显著增加。总体而言，这些结果表明，LMPST2通过调节肝细胞中脂肪酸氧化途径，抑制了细胞内脂质积累，降低了PA处理后HepG2细胞内的TG和FFA含量。

Discussion

先前的研究描述了马尾藻中发现的生物活性成分（如多糖、脂类和酚类化合物）的广泛效应，其中，多糖因其功能性引起了越来越多的关注，因此，大多数现有研究集中在海洋来源的多糖上，然而对于海洋来源的低聚糖的结构特征和生物学特性关注度较低，关于低聚糖的生物活性及其可能发生的化学和分子特征变化的报道更少。因此，在本研究中，评估了STCF3中低分子量多糖（LMPST）对脂质的抑制作用，并在PA诱导的3T3-L1和HepG2细胞中研究了其潜在机制。

SEM、FTIR、MALS和MS光谱确定了本研究中的结构和物理特性，化学成分分析验证了LMPST中多糖水平极高。此外，LMPST中葡萄糖含量最高。红外光谱分析表明，STC、STCF3和LMPST都含有C-O-C糖苷键、C-OH键和葡聚糖中的C=O键。平均分子量结果显示LMPST2具有最低的分子量，从STCF3中成功纯化出低分子量多糖。显微镜显示，STCF3和LMPST2都有规则的圆形表面。总体而言，以上发现表明纯化的LMPST2具有低分子量葡聚糖-低聚糖的结构特征。

SEM、FTIR、MALS和MS光谱确定了本研究中的结构和物理特性。化学成分分析验证了LMPST中多糖水平极高。此外，LMPST中葡萄糖含量最高。红外光谱分析表明，STC、STCF3和LMPST都含有C-O-C糖苷键、C-OH键和葡聚糖中的C=O键。平均分子量结果显示LMPST2具有最低的分子量。此外，从STCF3中成功纯化出低了分子量多糖。显微镜显示，STCF3和LMPST2都有规则的圆形表面颗粒。以上结果表明，纯化的LMPST2具有低分子量葡聚糖-低聚糖的结构特征。

白色脂肪组织（WAT）的主要功能是储存从食物代谢中获得的多余能量。组织以高浓度TG的形式将多余能量储存在细胞质中，因此，过度摄入食物会导致WAT中TG积累过多，从而引起脂肪肥大和增生。脂肪生成过程部分由脂肪生成蛋白如PPAR-γ、C/EBP-β和C/EBP-α调节。早期研究关注了C/EBP-β通过增加PPAR-γ配体来调节PPAR-γ表达和活化水平，而活化的PPAR-γ增加C/EBP-α蛋白表达。此外，这些脂肪生成蛋白被逐渐调节。根据这些发现，LMPST2处理通过调节脂肪生成PPAR-γ、C/EBP-α和C/EBP-β的表达水平，显著减少了细胞内脂质积累以及FFA和TG水平。这些结果与Mazibuko-Mbeje等人的研究结果相似。早期研究报道从海带中提取的富含葡萄糖的低分子量多糖在体外研究中显示具有明显的油保持和胆固醇结合能力。简言之，建议LMPST通过调节C/EBP-PPAR-γ来减少脂质积累，并可能具有油保持能力。

脂解过程在3T3-L1细胞中由脂解蛋白（包括p-AMPK、p-HSL和ATGL）介导。在这些蛋白中，p-HSL和ATGL是最重要的脂解蛋白。ATGL在TG水解中起着重要作用，生成的二酰基甘油进一步与p-HSP一起水解并转化为单酰基甘油（MAG）。最后，MAG分解为FFA和甘油，并从脂肪细胞中释放出来。我们的研究结果表明，LMPST2显著增加了p-AMPK-ATGL和p-AMPK-p-HSL级联反应，从而刺激PA处理的3T3-L1细胞中的脂解。

肝脏作为一个辅助消化器官，在脂质代谢、脂质合成和循环中扮演重要角色。由于高脂或高热量摄入，肝功能可能会失效，导致严重的肝功能障碍，并引发其他疾病，如非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪肝病。CPT-1和PPAR-α是参与游离脂肪酸氧化的两种蛋白质，在游离脂肪酸氧化途径中，它们有效地逆转了过多的肝脂积累。它们在线粒体β-氧化、脂肪酸摄取、脂蛋白在肝细胞中的组装和运输中起着重要作用。因此，研究了LMPST2对PA诱导的脂质积累的影响。

Conclusion

总之，LMPST2通过下调脂肪生成蛋白表达（如C/EBP-α、C/EBP-β和PPAR-γ），以及上调脂解蛋白表达（如ATGL、p-HSL和p-AMPK），改善了PA处理的3T3-L1细胞中过多的细胞内脂质积累和FFA水平。此外，在PA处理的HepG2细胞中，通过上游调节与游离脂肪酸相关的蛋白（包括PPAR-α和CPT-1），肝脏脂质积累、TG和FFA水平也显著下降。总的来说，研究结果表明，马尾藻是改善肥胖及其并发症的一个可行的药用选择。

Effects of low molecular weight polysaccharide from Sargassum thunbergii against palmitic acid-induced intracellular lipid accumulation in 3T3-L1 adipocyte and HepG2 cells

Hyo-Geun Leea, D.P. Nagahawattaa, M.J.M.S. Kureraa,b, Kyung-Mo Songc, Yun-Sang Choic, You-Jin Jeona,*, Min-Cheol Kangc,*

a Department of Marine Life Sciences, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea

b Department of Biotechnology, Faculty of Agriculture and Plantation Management, Wayamba University of Sri Lanka, Makandura, Gonawila (NWP) 60170, Sri Lanka

c Research Group of Food Processing, Korea Food Research Institute, 245, Wanju 55365, Republic of Korea

*Corresponding author.

Abstract

Low molecular weight polysaccharides can be isolated from Sargassum thunbergii (LMPST) and in vitro experiments were conducted to evaluate the inhibitory effects on lipids. Two natures of LMPST were attained from S. thunbergii and appraised their LMPST on palmitic acid (PA) induced lipid accretion in HepG2, and 3T3-L1 cells. LMPST treatment lessened lipid deposition and intracellular free fatty acid and triglyceride intensities in PA-treated above mentioned cells. The mechanistic study publicized that LMPST2 significantly suppressed adipogenesis and stimulated the PA-treated 3T3-L1 cells occupied in the lipolysis pathway. Furthermore, in PA-treated HepG2 cells, the free fatty acid oxidation was significantly increased by LMPST2. Given these constructive properties of LMPST2 from S. thunbergii, is a potential candidate for diminishing the intracellular lipids, and for a therapeutic agent in those conditions.

Reference:

LEE H G, NAGAHAWATTA D P, et al. Effects of low molecular weight polysaccharide from Sargassum thunbergii against palmitic acid-induced intracellular lipid accumulation in 3T3-L1 adipocyte and HepG2 cells[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 2244-2252. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250187.

翻译：王诗语（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片来源：图虫创意