畜禽屠宰后从肌肉向肉转变的过程主要是肌肉中蛋白质的变化，已有研究表明，蛋白质翻译后修饰是影响肉品质的重要因素，蛋白质翻译后修饰通过改变相关蛋白的结构和功能，影响能量代谢、肌肉收缩、应激反应等过程。畜禽宰后肌肉细胞并没有完全死亡，仍能存活数小时，在此期间能量代谢从有氧代谢转换为糖酵解，糖酵解是宰后肉的主要能量代谢方式。异质肉的发生与糖酵解途径密切相关，糖酵解速率过快易导致PSE（pale, soft, exudative）肉，糖酵解速率过慢易导致DFD（dark, firm, dry）肉。宰后早期糖酵解进程主要受糖酵解酶调控，酶活性变化影响糖酵解速率，进而影响宰后肉的pH值变化，而pH值与肉的持水性和肉色密切相关，因此调控宰后早期糖酵解进程至关重要。
糖酵解是生物体在缺氧条件下获取能量的主要途径，糖原经过一系列酶促反应生成丙酮酸，同时产生ATP和还原型辅酶I。丙酮酸激酶是糖酵解途径的限速酶之一，催化糖酵解最后一步反应产生丙酮酸和ATP，其活性变化影响糖酵解进程。丙酮酸激酶可发生多种蛋白质翻译后修饰，改变其功能和结构，影响其酶活性。
宁夏大学食品科学与工程学院的黄小兰，中国农业科学院农产品加工研究所的陈丽、李欣*等从蛋白质翻译后修饰的角度出发，重点综述宰后肉中丙酮酸激酶磷酸化、乙酰化及S-亚硝基化修饰对其活性和结构的影响，及其通过影响糖酵解进程进而调控肉品质的相关研究进展。
1 丙酮酸激酶概述
1.1 丙酮酸激酶结构
丙酮酸激酶几乎在所有生物体中都以同源四聚体存在，其单体亚基主要包括A、B、C、N 4 个结构域，每个亚基大约由531 个氨基酸残基组成，不同来源丙酮酸激酶各结构域之间氨基酸残基组成及数量存在一定差异；其单体分子质量约为60 kDa，二聚体分子质量约为110 kDa，四聚体分子质量约为220 kDa。在哺乳动物中，丙酮酸激酶存在4 种同工酶：丙酮酸激酶M1（PKM1）、丙酮酸激酶M2（PKM2）、L型丙酮酸激酶（PKL）及R型丙酮酸激酶（PKR），其中PKM1、PKL、PKR以四聚体形式存在，PKM2以二聚体和四聚体形式存在。PKL和PKR在肝脏和红细胞中表达，PKM1在成熟细胞和分化细胞中表达，而PKM2在胚胎细胞和癌细胞等活跃生长的细胞中表达。如图1所示，A结构域是3 个结构域中最大的，由2 个跨越43～115（A1）和219～387残基（A2）的片段组成，由α-螺旋与β-折叠构成桶状拓扑结构；B结构域只包含1 个β链，包含116～218残基，存在于A结构域的β3链和α3螺旋之间；C结构域残基在388～530之间，具有1 个α+β拓扑结构；N端残基在12～42之间，由1 个短的螺旋-旋转-螺旋序列组成。
1.2 丙酮酸激酶的催化机理
丙酮酸激酶活性位点位于结构域A和B之间的一个口袋中，其活性位点包括2个精氨酸、1个赖氨酸、2个天冬氨酸和2个谷氨酸残基。丙酮酸激酶的活化除了需要1个一价阳离子（K+）外，大多数丙酮酸激酶还需要1 个二价阳离子（Mg2+或Mn2+）。Mg2+或Mg2+与K+共同作用加大丙酮酸激酶活性部位暴露程度，磷酸烯醇式丙酮酸或其与ADP共同作用可降低丙酮酸激酶活性部位暴露程度。研究发现蛋白质翻译后修饰可以调控酶的活性，使丙酮酸激酶结构从四聚体转变为二聚体，可能是由于发生修饰后导致特定位点与1,6-二磷酸果糖（FBP）的亲和力降低，破坏了FBP介导的丙酮酸激酶激活所需的信号转导网络，从而改变酶的活性，FBP的结合导致丙酮酸激酶四聚化，而FBP的释放会导致丙酮酸激酶转换为二聚体，如图2所示。
变构效应是指一些小分子化合物与蛋白质的特殊位点结合后改变蛋白质的理化特性和生物活性的现象。丙酮酸激酶是一种具有变构效应的酶，其活性受变构激活剂和抑制剂的调控，变构激活剂主要包括FBP、丝氨酸和5-氨基-4-琥珀酸甲酰胺咪唑核糖核苷酸，ATP、草酸、丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲状腺激素可作为PKM2的变构抑制剂。PKM2受到FBP的正向调节，当其以低活性的二聚体形式存在时，会诱导FBP水平增加 ，当FBP达到一定高浓度后刺激PKM2二聚体向四聚体转变，从而促进糖酵解过程产生能量。研究发现，磷酸酪氨酸肽与PKM2结合导致变构激活剂FBP被释放，使PKM2构象发生变化、PKM2酶活性受到抑制。丝氨酸可以结合并激活PKM2，提高丙酮酸激酶对底物的亲和力，当丝氨酸水平较低时，对PKM2的变构激活效果降低，导致糖酵解途径中相关代谢物迅速转向丝氨酸的生物合成，以弥补丝氨酸的不足，一旦丝氨酸水平再次升高，PKM2形成四聚体，活性升高，催化丙酮酸的生成，去除糖酵解中间体。此外，5-氨基-4-琥珀酸甲酰胺咪唑核糖核苷酸也可变构激活PKM2，当细胞葡萄糖饥饿时，细胞内5-氨基-4-琥珀酸甲酰胺咪唑核糖核苷酸浓度升高，激活丙酮酸激酶活性。
2 丙酮酸激酶的功能
丙酮酸激酶的功能主要包括代谢功能和非代谢功能，如图3所示。代谢功能主要是参与糖酵解过程，催化糖酵解最后一步反应。畜禽宰后肌肉糖酵解速率与肉品质密切相关，研究发现，丙酮酸激酶可作为肉色、嫩度的潜在生物标志物，高丙酮酸激酶浓度和活性意味着肌肉组织糖酵解代谢升高。研究表明，丙酮酸激酶同工酶M1/M2亚型含量与肉的红度值（a*）和高铁肌红蛋白还原酶活性呈负相关。氧化损伤可使蛋白质特定的氨基酸侧链不可逆地转化为碳基，研究发现，高嫩度组肉中细胞凋亡酶3活性降低增加了PKM2的氧化损伤，影响丙酮酸激酶结构和功能。在宰后不同肉品质处理组中，高品质组糖原含量较低，糖酵解时间延迟，丙酮酸激酶表达量下调。此外，研究发现，调控PKM的基因表达可改变丙酮酸激酶在体内的存在形式，改变酶的功能。丙酮酸激酶M1和M2亚型由PKM的基因对外显子9和10的选择性剪切表达。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）对宰后肌肉能量平衡和调控糖酵解具有重要作用。AMPK含量和活性变化调节丙酮酸激酶的活性，影响肌肉糖酵解，在同一温度下，当AMPK活性较高时，丙酮酸激酶活性也较高。畜禽年龄、性别、遗传因素、宰前管理等因素影响宰后肉中丙酮酸激酶活性和糖酵解进程。Zou Bo等研究发现，相较于传统处理方式（电刺激5 min），温和处理（宰前休息5 min）可以降低PSE肉和DFD肉的发生率。夏季运输3 h后丙酮酸激酶活性增加，肌肉糖酵解迅速，肉品质降低，而在饲粮中添加单水肌酸能够减缓肌肉糖酵解速率。蛋白质磷酸化是调控丙酮酸激酶活性的重要因素，Lametsch等研究表明，RN基因型猪肉丙酮酸激酶磷酸化水平高于野生型。畜禽宰后贮藏过程中，不同贮藏温度和包装方式也可通过调控糖酵解途径影响肉品质。冰温贮藏可通过减缓丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶活性的变化，延缓糖酵解进程，降低乳酸积累速率。研究发现，冰温处理可以降低鸡胸肉丙酮酸激酶活性，延缓鸡胸肉的宰后成熟进程。DFD肉的发生与糖酵解途经中的关键调控酶密切相关，研究发现，高氧气调包装和一氧化碳包装可以改善DFD肉的色泽，减少汁液损失。
丙酮酸激酶M2亚型具有非代谢功能，作为一种蛋白激酶，催化多种蛋白底物发生磷酸化，调节瓦氏效应、肿瘤细胞转移、基因表达、有丝分裂和胞质分裂进程、细胞增殖及凋亡等。通过体外结合和激酶分析发现，PKM2磷酸化p21激活激酶2（PAK2）的Ser20、Ser141、Ser192和Ser197位点促进PAK2-热休克蛋白90的关联来稳定PAK2，以提高胰腺导管腺癌的细胞侵袭能力，促进肿瘤转移。PKM2可催化突触体相关蛋白23的Ser95位点磷酸化，促进肿瘤细胞外泌体释放。在肉品科学领域，丙酮酸激酶的代谢功能主要是调控宰后肌肉糖酵解，而非代谢功能在肉品科学领域中所发挥的作用仍不明确，是否可以利用这一特性改变肌肉蛋白功能、调控肉品质尚不清楚。
3 丙酮酸激酶翻译后修饰影响肉品质机制
研究发现，丙酮酸激酶可作为表征肉品质的潜在生物标志物，蛋白质翻译后修饰影响丙酮酸激酶的功能。丙酮酸激酶作为糖酵解的限速酶，在糖原转化为乳酸过程中起关键作用，其可发生磷酸化、乙酰化、S-亚硝基化、泛素化、甲基化等多种翻译后修饰，调控丙酮酸激酶的不同功能，促使丙酮酸激酶在活性四聚体和低活性二聚体间相互转换，改变结构稳定性，如表1所示。丙酮酸激酶翻译后修饰通过改变酶的功能及结构影响糖酵解进程，糖酵解主要通过影响宰后肉的pH值、色泽、保水性等影响肉品质。研究发现，PSE肌肉中丙酮酸激酶的活性是正常肌肉的2 倍，丙酮酸激酶活性与肌肉pH值、保水性和光反射值呈显著或极显著相关。Schwägele等发现，PSE猪肉的丙酮酸激酶催化效率比正常肌肉高10 倍以上，比较2 种来源丙酮酸激酶的pH值依赖性发现，PSE肌肉丙酮酸激酶将其pH值依赖性转移到酸性pH值，磷酸化PKM使其产生一种更利于存活于酸性环境的异构型，因此在PSE肉中丙酮酸激酶仍具有活性，并且能够产生ATP和丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下形成乳酸，导致肌肉pH值持续下降，这可能导致PSE肉品质下降。目前，肉品领域中丙酮酸激酶翻译后修饰主要涉及蛋白质磷酸化、乙酰化和S-亚硝基化，其对肉品质的影响如表2所示。
3.1 磷酸化
蛋白质磷酸化是指在蛋白激酶的催化下将ATP上的磷酸基团转移到底物蛋白氨基酸残基上的过程。磷酸化是调控蛋白质的主要翻译后修饰之一，针对蛋白质磷酸化影响肉品质机制的研究表明，蛋白质磷酸化调节肉的嫩度、色泽、保水性等品质。研究发现，PKM2的T45位点磷酸化可以使其与肌球蛋白轻链2结合并磷酸化肌球蛋白轻链2的Y118位点。PKM2的Tyr105位点磷酸化阻碍FBP对PKM2的变构激活，抑制PKM2四聚体形成，糖酵解中间体进入生物合成代谢，支持肿瘤生长。在脂肪细胞中，蛋白酪氨酸磷酸酶1B优先与PKM2的Tyr105和Tyr148位点结合，抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B可增加PKM2 Tyr105位点的磷酸化，导致其活性降低。
研究表明，丙酮酸激酶磷酸化与宰后早期糖酵解速率相关。Chen Li等通过对不同糖酵解速率羊肉进行定量磷酸化蛋白质组学分析，发现糖酵解速率慢的处理组中丙酮酸激酶Thr157位点磷酸化水平上调，丙酮酸激酶活性升高。研究发现，不同糖酵解速率处理组中，丙酮酸激酶磷酸化水平差异显著，快速糖酵解组宰后1 h丙酮酸激酶丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平高于慢速糖酵解组，而宰后24 h快速糖酵解组丙酮酸激酶丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平低于慢速糖酵解组。糖酵解速率慢，肉品质表现出较低的嫩度、保水性和a*，与慢速糖酵解组相比，快速糖酵解组的丙酮酸激酶活性升高，但丙酮酸激酶磷酸化和乙酰化修饰与酶的活性之间相关性不显著，可能是由于蛋白质乙酰化影响了丙酮酸激酶的代谢或非代谢功能，且蛋白质翻译后修饰间存在相互作用。除丙酮酸激酶外，其他糖酵解酶翻译后修饰也被证明影响糖酵解进程和肉品质。研究发现，糖酵解途径中糖原磷酸化酶磷酸化修饰通过调控酶的活性调节糖酵解速率，缓解了肌肉pH值的下降速率。在不同糖酵解速率肌肉中，糖酵解速率缓慢组糖原磷酸化酶的磷酸化水平和酶活性低于快速糖酵解组，糖原磷酸化酶活性与磷酸化水平显著正相关。以上研究表明，丙酮酸激酶磷酸化修饰对酶活性的调控具有重要影响，不同位点的磷酸化修饰对酶活性存在抑制或促进作用。
3.2 乙酰化
乙酰化是指在乙酰转移酶的调控下，将乙酰基转移到特定氨基酸上改变目标蛋白功能的过程。丙酮酸激酶乙酰化改变其活性、蛋白稳定性和蛋白激酶功能，不同的乙酰化促进剂和抑制剂可以调控丙酮酸激酶的乙酰化水平，改变蛋白功能。细胞质中去乙酰化酶SIRT2可去除PKM2中Lys305乙酰基，乙酰化阻止PKM2的四聚化而降低酶活性。高葡萄糖浓度刺激肿瘤细胞中PKM2的Lys305位点乙酰化，降低PKM2的活性和含量，组蛋白乙酰转移酶促进PKM2的Lys305位点乙酰化，降低PKM2的含量。p300是PKM2在K433位点的乙酰转移酶，K433位点乙酰化抑制PKM2与FBP的结合并降低酶活性，促进PKM2的核积累和蛋白激酶活性。组蛋白去乙酰化酶8可以结合并去乙酰化PKM2的Lys62残基，导致PKM2核定位并与β-连环蛋白结合，从而促进细胞周期蛋白D1基因的转录和细胞周期进程。此外，向动物活体内注射去乙酰化酶抑制剂和乙酰转移酶抑制剂也可以调控丙酮酸激酶乙酰化水平，注射去乙酰化酶抑制剂使肌肉具有更低的pH值、更高的乳酸含量和糖酵解酶活，有利于增加丙酮酸激酶活性，宰前应激可以提高肌肉乙酰化水平，促进糖酵解，而注射乙酰转移酶抑制剂可以减少由应激引起的丙酮酸激酶活性的增加。
蛋白质乙酰化可以通过调控宰后肌肉糖酵解、肌肉收缩、细胞凋亡等影响肉品质。Jiang Shengwang等研究表明，蛋白质赖氨酸乙酰化可能通过调节糖酵解和肌肉pH值、细胞应激反应、肌肉收缩影响从肌肉向肉的转变，同时鉴定到丙酮酸激酶有9 个乙酰化位点（K89、K135、K162、K186、K206、K224、K311、K475、K498），其中有5 个位点（K89、K135、K206、K224和K311）乙酰化水平下降，进一步研究宰前应激对肌肉丙酮酸激酶乙酰化修饰的影响，发现乙酰化抑制丙酮酸激酶活性而去乙酰化上调酶活性，并通过小鼠实验验证了宰前应激能够降低PKM1的K141位点乙酰化水平，从而增加其酶活和促进肌肉糖酵解。Jiang Yan等通过向猪腹腔注射乙酰化促进剂或抑制剂，分析宰后糖酵解速率，发现注射乙酰转移酶抑制剂可以降低宰后猪斜方肌、大腰肌和半腱肌的能量代谢率。由此可见，丙酮酸激酶乙酰化抑制其酶活性。
3.3 S-亚硝基化
蛋白质S-亚硝基化是指一氧化氮作为一种信号分子与半胱氨酸巯基结合形成S-亚硝基硫醇的过程。蛋白质S-亚硝基化通过调控钙离子通道、蛋白水解相关酶活性、肌肉收缩和糖酵解影响宰后肉品质的形成。Lu Wenwei等研究发现，猪肉蛋白质S-亚硝基化与能量代谢之间存在关联。研究发现，PSE猪肉中糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶3 种酶活性均高于RFN肌肉，而RFN猪肉中糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的S-亚硝基化水平较高。一定剂量NO处理可以提高肉保水能力、降低剪切力和肉硬度，使肌细胞结构更松散，NO处理能够以剂量依赖的方式改善猪肉品质。NO通过S-亚硝基化直接抑制PKM2的酶活性来改变糖酵解。
综上所述，丙酮酸激酶翻译后修饰影响肉品质可能通过影响丙酮酸激酶的结构使其活性发生改变，影响宰后肉的糖酵解速率、肌肉收缩、蛋白降解等（图4）。同时，PKM2特有的蛋白激酶功能可能是影响肉品质的一条新路径。
4 结语
丙酮酸激酶活性变化通过影响糖酵解进程影响肉品质的形成，蛋白质翻译后修饰是调控丙酮酸激酶活性的重要因素之一。本文重点综述丙酮酸激酶磷酸化、乙酰化和S-亚硝基化对其酶活性及功能的影响，丙酮酸激酶通过发挥代谢功能影响糖酵解，进而影响肌原纤维蛋白的降解，导致肉品质改变，其非代谢功能可能是影响肉品质的潜在通路，但非代谢功能在肉品科学领域中所发挥的作用仍不清楚，是否可以利用这一特性改变肌肉蛋白功能、调控肉品质仍需进一步研究。丙酮酸激酶可以发生多种蛋白质翻译后修饰，不同修饰对丙酮酸激酶活性和功能的调控机制不同，目前主要研究了单一蛋白质翻译后修饰对酶活性的影响。因此，需要进一步探究丙酮酸激酶发生2 种及2 种以上翻译后修饰对其酶活性的影响及引起酶活性改变的分子机制，为肉品质调控技术提供理论依据。
通信作者：
李欣，博士，研究员，硕士生导师，中国农业科学院农产品加工研究所肉品科学与营养工程创新团队科研骨干，博士毕业于瑞典农业科学大学肉品科学专业。主要从事生鲜肉保鲜减损机理和新型冷链物流技术研究，主持国家重点研发计划国际合作项目、国家自然科学基金面上项目等国家级项目8 项，发表学术论文80余篇，获授权专利43 项，参与制定农业行业标准6 项，获国家科技进步二等奖、神农中华农业科技奖一等奖等国家、省部级奖励6 项。担任中国畜产品加工研究会理事和首届青年工作委员会委员、ISO/TC34/SC6委员会国内技术对口工作组专家，食品领域学术期刊《Food Science of Animal Products》《肉类研究》编委，“科创中国”肉类加工产业服务团专家，被评为农产品加工业十佳杰出青年科技人才称号。
第一作者：
黄小兰，宁夏大学食品科学与工程学院硕士研究生，研究方向为肉品科学与技术。
本文《丙酮酸激酶翻译后修饰影响肉品质研究进展》来源于《食品科学》2024年45卷16期303-310页。作者：黄小兰，陈丽，任驰，摆玉蔷，侯成立，李欣，罗瑞明，张德权。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230601-006。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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