包括抗体在内的治疗性蛋白已经在多个治疗领域取得突破，成为主要治疗选择之一。然而，机体产生的各种“负面”的免疫反应是开发蛋白药物的挑战之一，包括抗药抗体（ADA）、免疫相关输注反应、过敏、细胞因子释放综合征（CRS）等。其中，ADA是评估免疫原性的主要指标。ADA既可以通过阻断作用位点，直接中和蛋白药物的药效，也可以通过加速药物清除间接影响药效。辉瑞开发的PCSK9抗体bococizumab就因为在多个Ⅲ期临床研究中发现了高比例的ADA，并影响药效，最终停止开发。除了有效性，ADA对安全性也是个隐患。比如严重输血依赖性肾功能衰竭患者，皮下注射重组促红细胞生成素治疗，可能会引发贫血，就与产生的中和抗体相关。

当然，并不是ADA发生率高，就一定会影响药物成药，需要衡量临床的获益-风险比。例如，抗TNFα抗体阿达木单抗是一种临床成功的药物，已获得至少九种不同慢性炎症适应证的批准。此外，阿达木单抗位列有史以来最畅销治疗药物之一，蝉联全球药王好多年，其峰值年销售额超过200亿美元。然而，虽然不同数据有些出入，阿达木单抗的ADA发生率在3% -61%之间。甚至有些研究显示，高水平的ADA会影响阿达木单抗的暴露量并降低治疗效果。

阿达木的案例并不意味着没有临床后果，就可以默认高浓度ADA存在。毕竟ADA对安全性和有效性的风险是客观存在的，如果在临床阶段将ADA研究透彻，以确定ADA与疗效、药代动力学或安全性之间是否存在相关性，需要进行大样本评估，费用和时间成本都很高。辉瑞的PCSK9抗体就是个很好的例子，项目推进到Ⅲ期阶段再折戟的代价太高。最好还是从源头控制蛋白药物的ADA风险。本文围绕蛋白药物的免疫原性这一主题展开讨论。之前写过一篇类似主题，，本文作了进一步补充和完善。

ADA的形成

ADA的产生是一个涉及多步骤的复杂过程，先天免疫系统和适应性免疫系统均参与其中。这一过程通常从来自先天免疫系统的抗原递呈细胞（APCs）开始。蛋白药物经过静脉或皮下等系统给药途径进入体内后，在到达靶部位之前，就会遇到来自血液、皮肤或淋巴管中的APCs（如树突状细胞, DC），代表性的DC细胞群包括皮肤中的DC、血液中的浆细胞样DC、肝脏中的枯否细胞及大脑中的小胶质细胞。这群细胞可以整合生物分子本身及其周围微环境中的信号，并转化为内部下游信号，最终决定是免疫耐受还是产生免疫原性。DC细胞几乎存在于人与外界环境接触的所有区域。

DC通过内吞作用摄取蛋白药物。DC细胞吸收蛋白药物主要依赖两条路径：1）降解途径，即通过酸性小体/溶酶体将蛋白分解成肽段，并加载到主要组织相容性复合体Ⅱ上，之后呈递到细胞表面；2）非降解途径，通过内吞、再循环、再释放，延长生物药半衰期。

降解途径主要通过几个表面受体家族和受体非依赖的巨胞饮作用实现。目前研究比较多的受体包括：1）模式识别受体，比如热休克蛋白受体或Toll样受体；2）C-type lectin家族，如DEC-205、DC-SIGN；3）Fcγ受体；4）MHC-Ⅱ蛋白家族，如HLA-DR、HLA-DQ；5）CD1蛋白家族；6）补体受体。这些受体可以使不成熟DC捕获、内吞大量蛋白药物，比如治疗性抗体、多肽、脂质、多糖或糖蛋白。不成熟DC细胞还能以巨胞饮这种被动扩散的非受体依赖的形式摄取目标蛋白。

DC细胞的非降解途径主要通过3个受体实现：1）甘露糖受体；2）FcγRⅡB；3）新生儿受体（FcRn）。甘露糖受体通过结合含甘露糖的蛋白，介导其内吞，并转运至再循环内体中，阻止了被溶酶体降解。FcγRⅡB可以捕获蛋白药物-抗药抗体免疫复合物（ICs），并将ICs再循环到细胞表面，主要意义在于保护了外周的ICs，被DC从外周顺利运送至脾脏，并激活B细胞。相反，肝脏枯否细胞表面的FcγRⅡB结合ICs后，会直接将其转运至溶酶体，并发生降解，从而降低了药物的半衰期。所以，不同解剖位置的DC细胞表面的FcγRⅡB介导的作用有可能是完全相反的。FcRn这个受体大部分人相对比较熟悉，具备延长IgG分子半衰期的作用。DC细胞表面的不同受体及配体清单如下表所示。

DC细胞的摄取、处理和递呈只是走完了ADA形成的第一步。作为T细胞表位的降解肽段，会与DC表面的MHC-II分子形成非共价分子复合物。这些肽-MHC-II复合物会被适应性免疫系统中CD4+辅助性T细胞表面的相应T细胞受体（TCRs）特异性识别，从而激活辅助性T细胞，进而激活适应性免疫系统中的特定B细胞。T细胞和B细胞之间的这种相互作用也依赖于TCR对特定肽-MHC-II复合物的识别。同时，这些B细胞还会通过膜结合抗体（即B细胞受体，BCRs）选择性识别蛋白药物上的B细胞表位。这一免疫过程最终导致B细胞分化为浆细胞，浆细胞分泌抗药抗体。这其中，Naïve B细胞激活又分为CD4+T细胞依赖型和非依赖型。不过，超过90% ADA的形成是依赖CD4+T细胞的。

CD4+T细胞非依赖型：BCR识别的表位（B cell epitope）既可以是线性的，也可以是3D空间结构。如果脾脏边缘区的B细胞直接与携带抗原的DC细胞接触，就可以不依赖T细胞，直接活化B细胞。这种抗原有一定特征，通常是带有重复的蛋白表位或某些多糖（如革兰氏阳性细菌细胞壁中的重复多糖），这些抗原可以直接通过交联多个BCRs或同时激活BCRs和Toll样受体来直接激活B细胞。交联可以增强信号强度，对其它辅助细胞的依赖就会减弱。另外，这类ADA通常是IgM亚型，且与抗原的亲和力偏低。最后，这类ADA反应不具备免疫记忆性。

CD4+T细胞依赖型：与IgM相反，IgG、IgE亚型的ADA通常是高亲和力、具备免疫记忆，且依赖CD4+T细胞。与B细胞识别的表位不同，T细胞识别的表位通常是12-30个氨基酸的短的线性肽。主要是由DC或B细胞降解产生，并由MHC-Ⅱ递呈到细胞表面。当CD4+T细胞识别这些肽段后，在共刺激分子协助下，开始增殖，分泌细胞因子。当活化的CD4+T细胞遇到含有相同肽段的B细胞后，就会促进这些B细胞活化、分化，形成可分泌IgG、IgE亚型ADA的浆细胞。

ADA产生过程如下图所示。

蛋白质治疗药物首次引发的ADAs通常是低亲和力的IgM型抗体。随后，B细胞中的DNA重组会导致抗体亚型转换为IgG、IgE或IgA。此外，抗体基因的快速突变（体细胞高频突变）可能会产生更高亲和力的抗体变体，这一过程称为亲和力成熟。在免疫反应成熟过程中，还可能发生表位扩展，导致ADAs针对蛋白药物上其他表位。

抗体治疗药物与其相应抗原之间形成的免疫复合物可以促进抗原呈递和ADA形成。例如，抗TNFα抗体英夫利西单抗与TNFα形成的免疫复合物会增加APCs呈递英夫利西单抗衍生肽段的MHC-II类分子。抗TNF/TL1A双特异性抗体AMG966在几乎所有接受治疗的健康志愿者中都引发了ADA，导致药物暴露量减少。AMG966与TNF和TL1A形成了大的免疫复合物，增强了其去糖基化Fc与FcγR1A和FcγRIIIA的结合。免疫复合物与FcγR的结合有助于AMG966的ADA产生。

ADA危险因素和免疫耐受

以疫苗为例，疫苗抗原被DC摄取后，T和B细胞并不足以被激活，不能形成足够的中和抗体。这就不得不提到佐剂的作用。佐剂主要是提供共刺激信号，上调DC和B细胞表面共刺激分子的表达，如CD40、CD86。或者上调活化T细胞表面CD40配体的表达。可以发挥类似佐剂作用的物质包括内毒素、热休克蛋白、细菌肽、脂类、多糖、病毒RNA/DNA序列。对于生物药来讲，则可以是杂质、赋形剂，如表面活性剂或金属离子。甚至注射针头给药刺激，也会提供共刺激信号。以上都可以作为提升ADA风险的危险信号。

有危险信号，自然也有免疫耐受情况。目前有以下几种方式可以诱导外周免疫耐受：1）激活天然CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞，即nTreg；2）蛋白本身包含Treg表位，即Tregitopes；3）诱导抑制性DC产生，这类DC细胞可分泌IL-10，并促进诱导型Treg(iTreg)产生；4）诱导浆细胞样DC产生，这类DC细胞可激活Treg，抑制效应T细胞作用；5）口腔粘膜给药，有证据表明当其它给药途径会产生高滴度ADA的干扰素，经粘膜给药后，免疫原性消失。所以，临床有开发干扰素α2b喷雾剂。原理也是与激活抑制性DC和iTreg有关；6）高剂量给药诱导免疫耐受：Infliximab或Abciximab重复高剂量给药后，免疫原性降低。推测原因是这类蛋白含有Tregitopes，激活nTreg需要DC细胞表面的高拷贝数的HLA-Tregitope，所以剂量越高，激活Treg的可能性越高。

影响ADA产生的风险因素

蛋白药物的免疫原性受到多种风险因素的影响，这些风险因素分为三大类：与产品相关、与患者相关以及与疾病相关，每一类又能具体细分为很多亚类，如下表所示。

1、产品方面

首先比较重要的是药物分子本身的特点，或者“先天因素”，首当其冲的就是氨基酸序列。嵌合抗体或融合蛋白中的非人源序列会增加免疫原性风险。但是，与分子量大的蛋白药物相比，含非人源序列的短肽更容易成为T细胞表位，免疫原性风险也会高很多。因为，这类短肽不需要内吞或蛋白降解，可以直接与DC细胞表面的MHC-Ⅱ分子结合。

生物药的聚体形式更容易成为B细胞表位，这类聚体可通过交联BCR激活B细胞，并且不需要共刺激信号，也不依赖T细胞的辅助。

除序列外，宿主细胞蛋白、化学合成多肽的副产物均会增加neo-epitopes风险，并可能发挥佐剂样作用，增强共刺激，增加免疫原性风险。

产品制剂方面，纯度、处方、剂量三个方面对免疫原性的影响需要考虑。尤其制剂的赋形剂成分，如表面活性剂，有增强共刺激信号的风险。

剂量和给药方案对ADA的影响也很关键，比较低的剂量下，产生的T细胞表位数量少，可能达不到充分激活T细胞的阈值。非常高的剂量下，则有可能引起免疫耐受，抑制免疫反应。除了给药剂量，给药频率对ADA也有影响。每天给药或更高频的给药方案，会导致Treg的激活，从而降低免疫原性风险。

药物靶点和作用机制对ADA也有影响，有些靶点位于免疫细胞，具备免疫调节活性，这类分子的免疫原性需要重点关注，比如CD40或CD25位于DC或其它APC细胞表面，产生ADA的风险较其它靶点要高。又如增强机体免疫的T细胞连接器，潜在ADA风险也会高一些。

2、患者和疾病方面

关于这点，需要重点考量的是患者的遗传背景。首当其冲的是人类白细胞抗原Ⅱ（HLA-Ⅱ）的基因型，因为HLA-Ⅱ决定着蛋白药物是否携带合适的T细胞表位。再就是编码全部TCR和BCR的基因，决定着能否识别任一T细胞或B细胞表位。此外，细胞因子基因多态性决定了T细胞和B细胞激活的阈值。其它风险因素包括患者给药之前或平行服用的其它药物。比如给予甲氨蝶呤或可的松这些免疫抑制药物，自然会降低药物的免疫原性风险。

不同疾病背景下，患者免疫状态不同，比如肿瘤和自身免疫性疾病。以嵌合CD20抗体rituximab为例，在淋巴瘤和白血病患者的ADA发生率很低（<2%），但当其用于治疗类风湿关节炎时，ADA发生率提高了10倍以上。

当然，ADA的发生风险往往不是来自单一因素，而是多因素交织在一起，共同发挥作用，从而引起免疫原性相关的不良反应或影响药物的药代动力学行为。

免疫原性风险测定

在临床前开发阶段，用于免疫原性风险评估的方法通常聚焦在T细胞依赖性ADA生成中的各个步骤。通过一些工具预测线性肽与MHC-II结合的紧密程度，或者预测肽段（T细胞表位）被MHC-II递呈的概率。通过计算机模拟方法预测的T细胞表位数量与观察到的临床ADA发生率之间至少是存在一定的弱相关性的。

以上如果算作干实验，还有些湿实验方法可用于免疫原性风险评估，比如树突状细胞负载实验（dendritic cell loading assays），模拟APCs对蛋白药物的摄取。又如，APC中MHC-II递呈的肽段，可以通过MHC相关肽段蛋白质组学（MAPPs）识别。此外，也可以直接测量肽段与MHC-II的结合。辅助T细胞的激活可通过检测生物标志物（如IL-2分泌）或细胞表面CD134和CD137表达来进行检测。T细胞增殖可通过使用荧光染料（如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯）或通过[3H]-胸苷或溴脱氧尿苷掺入来测量。

免疫原性的评估除了体外工具可用，自然也离不开体内评估。只不过，体内评估蛋白药物的免疫原性风险存在诸多挑战，因为临床前动物模型和人体免疫原性结果的相关性有限。小鼠免疫系统与人体系统在ADA生成机制方面存在诸多差异，包括MHC库和抗原呈递。即使是可以产生人IgG1抗体的转基因小鼠，这种差异也依然存在。别说小鼠，即使是非人灵长类比如猴，观察到的ADA也不具备人体预测能力。比如抗体类药物，非人灵长类动物中ADA的发生率与人体相当的情况仅占约59%。

那么ADA风险怎么评估更合适呢？建议是多种不同方法交叉评估，包括基于计算机的T细胞表位预测、APC细胞对蛋白的摄取、通过MAPPs对MHC-II免疫肽组进行特征分析等，并以不同ADA发生率的蛋白药物作为对照，emicizumab为5.1%；etanercept为3.6%-8.7%；abciximab为5.8%-44%；romosozumab为18.1%；blosozumab为35%；hA33为62.2%；bococizumab为48%。

降低免疫原性风险

降低免疫原性风险的最简单方法是选择一个符合目标候选物特征且在不同免疫原性检测中综合评分较低的分子。如果没有发现这样的低风险候选分子，可以选择对更多候选物进行免疫原性风险筛查。或者，也可以尝试对现有候选物进行去免疫原性处理，如去除可能的T细胞或B细胞表位。当然，后者处理起来挑战颇大，因为去除所有潜在的T细胞表位比较耗时且难以实现，但保留下来的某一个T细胞表位也可能对ADA产生重大影响。而且，去免疫原性的同时，还要兼顾药物的生物学活性和可开发性，不能顾此失彼。Emicizumab是一款抗IXa/X双特异性抗体，在分子设计阶段通过计算机模拟预测并随后移除T细胞表位，即去免疫原性处理，在Ⅲ期临床试验中观察到的ADA发生率比较低（5.1%）。

对于抗体治疗药物，已采用多种方法来降低其免疫原性风险。在超过170种获批的治疗性抗体中，只有大约8种是鼠源抗体。因免疫原性问题，鼠源抗体临床开发的成功率较低。意识到这一问题之后，后续已经开发出多种技术，通过用人类序列替换鼠源序列来降低鼠源抗体的免疫原性。包括20世纪80年代初提出的嵌合抗体——鼠源恒定区采用人源替代，仅保留结合抗原的鼠源可变区。几年后，Greg Winter开创了一种更复杂的蛋白质工程方法，即抗体人源化。在人源化过程中，仅保留鼠源抗体中关键的互补决定区以及可变区中影响抗原结合的关键框架区残基，而其余部分为人源序列替代。随后，从20世纪90年代开始，开发出了高效的全人抗体生成途径，包括人体抗体片段的噬菌体展示文库和全人抗体转基因小鼠。后续酵母展示文库等其它技术进一步加强了人源抗体的获得路径。当然，高度人源化只是从概率上降低了ADA发生率，并不意味着与ADA低发生率之间的绝对相关。毕竟序列只是影响ADA发生的其中一个因素而已。

ADA对药物ADME的影响

1、ADA对生物样品分析结果的影响

如果形成ADA，那么蛋白药物在体内就有两种存在形式，一是游离分子，二是与ADA结合的免疫复合物形式（ICs）。所以，我们需要弄清楚，建立的生物分析方法检测的是哪些成分，是游离分子，是ICs，还是所有形式药物总和。同理，如果建立的生物分析方法检测不到血药浓度了，也有几种可能，一是ADA的结合影响了检测，比如开发的检测配对抗体结合表位与ADA有交叉结合；二是ICs的形成加速了体内清除的过程。前者情形说明药物还在以ICs形式在体内循环，这种ICs可能依然具备药理活性，应该结合PK/PD结果进行关联分析，尤其是PK与PD不一致的时候。

2、免疫复合物的形成

ADA可以是中和抗体，也可以是非中和性质的。中和抗体比较容易理解，就是抗药抗体的结合位点，对于药物发挥生物学作用比较关键，比如结合在抗体药物的CDR区域。非中和抗体则相反，结合位点不太关键。两种类型抗体都会影响药物的清除，ADA产生的越多，这种影响越明显。

ICs的大小取决于蛋白药物表位的多少。如果药物只有一个B细胞表位，仅形成小的ICs，不能形成大的或者交联形式的复合物。相反，如果携带多个B细胞表位，则会形成比较大的ICs。特别提一下抗体药物，因其结构原因，抗体药物如果有B细胞表位，一般至少是两个。除了表位数量，药物与抗药抗体的比例也是影响ICs大小的关键。如果是1:1的比例，则容易形成下图C和D中的IC形式。Johansson及其团队在体外将抗体与抗药抗体1:1混合，发现主要形成的下图C中的环状四聚体，其次是D图中的环状六聚体，甚至还有八聚体和16-20聚体的存在。线性+开环链式聚体（图B）与环状聚体占比分别为30.3%和67.8%。当药物与ADA的比例不是1:1，无论药物过量还是ADA过量，更容易形成小片段的ICs。所以蛋白表位的多少及蛋白与抗药抗体的比例对于ICs的形成、大小比较重要。

3、免疫复合物的清除

ICs的清除很大程度上取决于分子的大小。包含1个或2个IgG的小ICs既不能激活补体，也不能交联Fcγ受体，可以持续在外周血循环，不会被免疫清除。大点的ICs可以激活补体，并被肝脏和脾脏的吞噬细胞摄取。没有补体的情况下，也会被外周血中的DC、巨噬细胞、单核细胞非特异性胞饮内吞或被更有效率的受体介导的内吞清除。这里请注意，DC细胞不只介导蛋白药物的摄取、递呈，也参与对后续形成的蛋白药物/ADA的免疫复合物的清除。

聊几句种属差异，在人和灵长类动物中，IgG1和IgG3亚型ICs主要激活经典的补体途径，即先结合C1q，再结合C3b，之后结合红细胞的补体受体（CR1），并被红细胞转运至肝脏或脾脏，最后通过FcγRⅠ、FcγRⅡA、FcγRⅢB、CR1、CR2、CR4或甘露糖受体被肝脏枯否细胞或脾脏巨噬细胞吞噬、清除。其中，FcγRⅠ与IgG单体的亲和力很高（KD~10-9M），FcγRⅡA、FcγRⅢB与IgG单体的亲和力就低很多，分别是>10-7M、>10-6M。因此，FcγRⅡA、FcγRⅢB主要介导多聚形式ICs的摄取。然而，啮齿类动物并不是依赖红细胞转运ICs的，而是血小板，这点是有种属差别的。

ICs被吞噬细胞或造血细胞摄取后，主要暂存于早期内体中。在pH<6.5的酸性pH条件下，ICs与FcγR的亲和力消失，发生解离，转而结合FcRn，并由FcRn完成后续的处理。对于单体IC（如上图A中所示），FcRn的处理类似于未形成复合物的免疫球蛋白药物，发挥的是保护作用。但是，对于多聚ICs，则被FcRn转运至溶酶体，并被降解，发挥清除作用。因此，FcRn给予不同大小ICs的待遇是不一样的。

4、ADA是延长蛋白药物半衰期还是加速药物清除？

对于分子量小于70KDa的蛋白药物，主要经肾脏消除，ADA的结合使分子量增加，不再经过肾脏消除，可以增加药物的持续时间。比如IL-2Rα，90%经肾消除，半衰期约4.8h，结合ADA后，半衰期延长到38h。又如IL-10，分子量35KDa左右，小鼠中的半衰期约0.04天，结合ADA后，半衰期延长到1.16天。

对于分子量比较大的蛋白药物，比如抗体，ADA通常会加快这类药物的清除。如果形成的是小的ICs，FcRn的保护作用虽然打了折扣，但还能保留几成功力，所以只是在一定程度上加快了清除，但幅度有限。但是，大的ICs，不仅FcRn的保护作用完全失去，转而会导致药物的快速清除。即使产生的ADA是非中和抗体，这种清除速度也会使药物药效大打折扣。当然，中和抗体性质的ADA对药物的影响就更严重了。但某些药物ADA的形成是一过性的，当ADA消退后，药物的消除又回到正常状态。当然，还有些特例情况，比如中和性质的ADA结合药物后，会阻断药物与靶点的结合，降低靶点介导的药物处置（TMDD），反而降低了药物的清除。

案例：动物试验中的加速清除

1.74mg/kg的Infliximab静脉输注给予食蟹猴，30分钟后，再给予0.5mg/kg的anti-infliximab抗体。5分钟后即形成ICs。大的ICs（>670KDa）被快速清除，24h的时候就已经检测不到。小的ICs可以持续存在，消除半衰期37.5h，比infliximab的105h短，但比大的ICs半衰期长。

5、ADA对分布的影响

ADA不仅会对药物的消除有影响，对分布的影响也不容忽视。对于小分子量的蛋白药物，如多肽，ICs的形成会降低药物的组织渗透能力，同时降低了药物的肾清除，增加了在肝脏的富集和清除。比如，游离IL-10主要通过肾脏清除，肾脏的浓度明显超过肝脏。当结合抗IL-10抗体后，新的复合物主要分布到肝脏，肾脏只有很少的摄取。这点对于大分子量的生物药也适用，当结合抗药抗体形成ICs后，肝脏和脾脏的分布及摄取增加，药物清除速度加快。

ICs可能会在肾小球、血管、滑膜、肺、肝、皮肤、眼睛、脉络丛等组织沉积。通常，小ICs较大ICs沉积的风险低。可能由于ICs清除路径饱和，导致大的ICs不能被快速清除。将小ICs和大ICs混合后注入小鼠，只要血循环中存在大的ICs（>mAb2ADA2），ICs在肾小球的沉积就会被观测到。还有一种解释ICs组织沉积的理论，带正电荷的ICs与细胞表面的负电荷的相互作用会促进凝集。ICs沉积的危害还是挺大的，比如会引发肾小球肾炎的风险。

6、ADA对药物吸收的影响

关于ADA对生物药吸收影响的相关研究非常少。在给药间隙如皮下，或者引流淋巴结是能发现ADA存在的。药物经过皮下给药后，或经过淋巴吸收后，会与ADA形成ICs，分子量出现比较大的变化，从而可能影响药物吸收速率或程度。

如何处理ADA对ADME的影响

1、处理ADA存在情况下的PK检测

无论开发什么样的PK检测方法，检测游离药物的也好，检测结合ADA的药物也好，ADA对方法学准确度的影响其实都会存在。不过，毕竟蛋白药物大部分是人源序列，相对于动物，人体的免疫原性风险是低的。一个简单粗暴的处理方法是，在计算PK行为时将ADA阳性的个体排除在外。

2、通过高剂量给药诱导免疫耐受

IFN-β临床通过SC或IM给药，治疗多发性硬化症。治疗过程中会出现中和抗体，并影响药物的药效。研究发现，临床输注高剂量IFN-β会降低中和抗体滴度。原因有二：1）短期输注大量IFN-β会使中和抗体饱和，过量的IFN-β可以继续发挥药效；2）长期看，高剂量IFN-β会引起免疫耐受。这一情况在IL-6受体抗体中也有发现。

3、通过免疫调节控制ADA负面影响

25%的A型血友病患者给予凝血因子VⅢ（FVⅢ）会产生中和抗体。如前文所述，通过提高剂量，给予大剂量FVⅢ可以抵消中和抗体的影响。不过，除了这个方法以外，最近的研究又出现了新的方案。通过将FVⅢ与CD20抗体rituximab联用，也达到了降低中和抗体滴度，解除中和抗体负面调控的效果。主要原因是rituximab耗竭了B淋巴细胞，使抗体的产生受到影响。

又如治疗庞贝病的酶替代疗法-α葡萄糖苷酶（rhGAA）。儿童给予rhGAA后，会出现持续高滴度的中和抗体，极大的影响了治疗效果。通过同时给予rituximab、甲氨蝶呤等免疫调节药，可引起免疫耐受，降低ADA的影响。

TNF-α抗体infliximab是人鼠嵌合抗体，鼠源成分的比例较传统人源化、全人源抗体高。临床同样面临ADA影响生物利用度、增加输注反应风险的问题。通过给予免疫抑制药物如硫唑嘌呤、巯基嘌呤或甲氨蝶呤可以抑制ADA的形成，降低输注反应发生率，优化治疗效果。

4、其它新型克服免疫耐受的方法

一种是在药物发现阶段，就对序列中的T或B细胞表位进行突变改造，从源头降低风险。另外一种是通过改变给药途径降低ADA风险，比如鼻吸入给药、消化道粘膜上皮给药等更容易激活Treg，增强免疫耐受。

ADA的检测

免疫原性评估应纳入每一项临床研究的方案设计中。由于ADA的多克隆性和异质性，无法为ADA样本赋予一个绝对定量的浓度。相反，ADA反应的强度通常以半定量的滴度单位表示。滴度值反映了ADA的浓度和亲和力。ADA通常采用分层检测策略来评估临床研究样本。目前常用的免疫原性检测范式是筛选、确认和表征（滴度检测）三级检测。筛选的目的是去除阴性样本，毕竟不太可能对所有样本开展滴度检测。但筛选也保留了一定的假阳性率。所以，确认这一步目的就是去除假阳性样本。最后一步是对确认阳性的样本进行滴度和中和活性检测。目前有多种平台可用于ADA分析，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和电化学发光免疫分析等。

典型的免疫原性三级检测步骤如下图所示，先对样本进行第一级的筛选，之后对筛选阳性的样本加样确认，最后对确认阳性的样本进行滴度检测和中和活性确认。实际工作中，并不是对所有阶段的临床样本均进行完整的三级检测。比如，中和活性检测通常在关键三期临床才开展。