撰文 |木兰之枻
生物体抵御病毒感染主要有两种途径：清除入侵的病毒，或阻断宿主细胞内病毒复制所必需的关键进程。这其中t RNA 失活是阻断病毒复制的一项重要机制【1】。例如，PrrC、VapC、大肠杆菌素E5和PARIS为代表的细菌防御系统均可通过切割特定tRNA的反密码子环来实现抗病毒感染。在动物体内，I型干扰素SLFN11与SAMD9也可通过切割tRNA的受体茎部与反密码子环以抑制特定密码子的翻译，最终阻止病毒颗粒的产生。
CRISPR- C as作为原核生物的获得性免疫系统，是细菌抵抗外源病毒感染的有力武器【2】。研究表明，多种CRISPR系统在crRNA引导下可靶向切割病毒DNA或RNA，从而抑制病毒感染；部分被激活的Cas核酸酶还具备旁系切割活性，能够非特异性地降解病毒相关的RNA或DNA，进一步阻断病毒复制。在已知的CRISPR抗病毒机制中，活化的 Lsh Cas13a可特异性识别并切割富含尿嘧啶（U）的靶标序列，实现针对性抑制；同时，它也能非特异性地切割部分tRNA中富含U的反密码子环【3】。然而， CRISPR系统能否通过特异性切割tRNA来实现抗病毒感染仍未有确切证据。
近日，来自德国亥姆霍兹RNA感染研究所的 Chase L. Beisel 实验室 与亥姆霍兹感染研究所的 D irk W. H einz 实验室 以及美国犹他州立大学 Ryan N. Jackson 实验室合作， 在 N ature 发表题为 RNA-triggered Cas12a3 cleaves tRNA tails to execute bacterial immunity 的论文 。文章 对V型Cas 12 a 3 核酸酶的抗病毒免疫机制进行了深入研究。研究首次证实活化的Cas 12 a 3 可对多种tRNA尾部进行切割，从而引发生长停滞和抗噬菌体防御。冷冻电镜结构进一步揭示，Cas12a3具有独特的tRNA装载结构域，可将tRNA末端精准定位至RuvC核酸酶活性中心。本研究揭示了新的C RISPR 抗病毒免疫机制，为未来的C RISPR 工具开发提供了新的方向。
文章伊始，研究者通过环境宏基因组数据挖掘和系统发育分析发现了两种新的Cas 12 a亚型Cas 12 a 3 和Cas 12 a 4 。它们在结构上保留了经典RuvC核酸内切酶的关键基序，以及与crRNA加工、PFS识别等过程相关的功能域。不过Cas12a3缺失了与DNA旁系切割活性相关的蛋白结构区域。质粒干扰实验指出，激活后的Cas12a3与Cas12a4可通过与Cas 12 a 2 类似的方式引发生长停滞，但具体机制存在明显差别。研究还发现，激活后的Cas 12 a 3 和Cas 12 a 4 可特异性切割 RNA 而非D NA 。体外转录-翻译体系（TXTL assay）结合纳米孔RNA测序分析证实，Cas12a3可特异性切割tRNA。其中激活后的 Ba1 Cas12a3可切割绝大多数tRNA（46/49），其切割位点主要位于tRNA 3 ’ 末端上游第3至5个碱基处。此外，无论tRNA是否发生化学修饰或是否携带氨基酸/功能基团，Ba1Cas12a3均能对其进行有效切割。
为阐明Cas12a3结合tRNA的具体机制，研究者利用单颗粒冷冻电镜对 Ba1 Cas12a3-crRNA-靶RNA-tRNA复合物进行了结构解析。分析结果表明， Ba1 Cas12a3具有与 Su Cas12a2相似的REC1/2、WED、PI、RuvC、ZR等结构域，以及一个插入结构域。该插入结构域的部分区域与 Su Cas12a2无显著同源性，且在PDB数据库中也未发现明显的结构相似序列。研究发现，该结构域可直接结合tRNA，并能协助将tRNA引导至RuvC活性中心，因此被命名为tRNA装载结构域（tRNA-loading domain，简称tRLD）。复合物结构中， Ba1 Cas12a3结合cr RNA 的方式与Cas 12 a/Cas 12 a 2 类似。此外，靶R NA 会与cr RNA 形成A型双螺旋，并贯穿蛋白中心区域，靶RNA的3 ’ PFS序列则由PI结构域夹持。 Ba1 Cas12a3复合物最显著的特征是与tRNA Ala(UGC) 在两个位点有特异性相互作用，一是T臂的磷酸骨架可通过氢键被REC2域中的小环识别；二是受体茎部与3 ’ CCA末端被夹持在tRLD与RuvC结构域之间。此外， Ba1 Cas12a3所结合的tRNA区域，与游离延伸因子EF-Tu或EF-Tu-核糖体复合物的结合区域相同，表明 Ba1 Cas12a3切割的是未参与蛋白质合成的游离tRNA。
为深入探究 Ba1 Cas12a3核酸酶活化及tRNA切割过程中的动态构象变化，研究者利用冷冻电镜技术，系统解析了 Ba1 Cas12a3-crRNA、 Ba1 Cas12a3-crRNA-靶RNA，以及 Ba1 Cas12a3- tRNA Ala(UGC) 3’ A CCA尾部等一系列结构。分析表明，靶RNA的结合可诱导 Ba1 Cas12a3-crRNA发生一系列构象重排。与 Su Cas12a2不同（其靶RNA识别后的构象变化即足以完成激活）， Ba1 Cas12a3中的tRLD结构域在激活后仍稳定位于RuvC活性中心附近。当RuvC完成对tRNA尾部的切割后，tRNA主体发生解离，但其末端的四核苷酸ACCA仍被RuvC与tRLD结构域捕获。此时， Ba1 Cas12a3保持激活构象并继续捕获切割其他tRNA。
C as12a3特异性切割tRNA的特性可直接用于多重RNA检测。该检测主要依赖于将Cas13核酸酶与正交RNA底物进行配对。为提升多重检测能力，需要引入具有不同正交底物偏好性的新型核酸酶。研究发现， Ba1 Cas12a3对带有3 ’ CCA尾及3 ’ 荧光基团的发夹结构具有最强的信号响应。基于此，该酶可与靶向富含尿嘧啶（U）RNA序列的 Lwa Cas13a、以及靶向富含腺嘌呤（A）RNA序列的 Psm Cas13b联用，共同实现多重RNA检测。验证实验表明，该组合系统可成功实现对SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒（RSV）及甲型流感病毒RNA转录本的高效检测。
总体而言，本研究发现广泛的tRNA失活是一种全新的CRISPR抗病毒免疫策略。研究者通过设计模拟tRNA受体茎部与末端的合成报告分子，有效拓展了CRISPR诊断技术在多重RNA检测方面的应用能力。
https://doi.org/10.1038/s41586-025-09852-9
制版人： 十一
参考文献
1. Elder, J. J. H., Papadopoulos, R., Hayne, C. K. & Stanley, R. E. The making and breaking of tRNAs by ribonucleases.Trends Genet.40, 511–525 (2024).
2. Nussenzweig, P. M. & Marraffini, L. A. Molecular mechanisms of CRISPR–Cas immunity in bacteria.Annu. Rev. Genet.54, 93–120 (2020).
3. Jain, I. et al. tRNA anticodon cleavage by target-activated CRISPR–Cas13a effector.Sci. Adv.10, eadl0164 (2024).
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