Nature | Hong Li团队揭示一种对CpG甲基化敏感的Cas9蛋白——ThermoCas9|cpg|dna|位点|甲基化|细胞|蛋白

CRISPR-Cas9系统作为当今最重要的基因编辑工具之一，可以精准识别目标DNA序列，实现定点编辑。却难以感知DNA 序列中的化学修饰。这些DNA化学修饰在表观遗传学中至关重要。例如胞嘧啶甲基化（5-methylcytosine, 5mC），在基因表达调控、细胞分化以及疾病发生中扮演着关键角色。如果能够发现一种对DNA化学修饰敏感的新型CRISPR-Cas9系统，在识别基因序列的同时感知表观遗传状态，特异性靶向编辑疾病相关的低甲基化基因将成为可能，为解决基因编辑技术的脱靶问题提供全新的维度。

2026年4月15日，美国Van Andel Institute（VAI）Hong Li教授团队在Nature发表文章Molecular Basis for Methylation-sensitive Editing by Cas9，首次系统揭示了一种对CpG甲基化敏感的Cas9蛋白——ThermoCas9，并从生化机制、结构基础到细胞功能层面全面解析了其作用机制及在人细胞中的应用潜力。这一成果突破了传统Cas9系统无法识别DNA甲基化状态的限制，为表观遗传信息的精准读取与编辑提供了新的技术路径。简单来说，就是让Cas9不只是“识别基因序列”，而是开始 “感知表观遗传学状态”。

在此之前，Hong Li团队已经发现另一种Cas9（AceCas9）对5mCpC有一定敏感性。然而，成熟体细胞组织中，5m CpG甲基化修饰更为常见，CpC甲基化修饰仅在胚胎干细胞中较为常见。相比之下，来自荷兰Wageningen University 的John Van Der Oost 团队鉴别了一种可以识别 CpG的Cas9——ThermoCas9，该Cas9有广泛的潜力在人类细胞中进行有效基因编辑。为此，两实验室展开了合作。于是，一个自然的问题出现了：

ThermoCas9能不能识别更常见的5mCpG甲基化？

在该研究中，研究人员首先系统评估了ThermoCas9对DNA甲基化的敏感性。此前研究表明，ThermoCas9具有较宽松的PAM识别特性，但其对PAM第5位胞嘧啶（C）具有严格依赖。基于这一特征，研究团队设计实验，重点检测该位点甲基化对酶活性的影响。

结果显示，一旦PAM第5位发生甲基化，ThermoCas9对两类PAM序列的切割活性均显著降低，表明其对5mCpC和5mCpG均具有明显敏感性。进一步分析发现，胞嘧啶甲基化对ThermoCas9的抑制具有链特异性：非靶链甲基化影响最大，靶链次之，而双链同时甲基化时抑制最强。相比之下，protospacer区域（包括seed区）的甲基化几乎不影响酶活性，说明ThermoCas9对甲基化的感知主要集中在PAM区域。

为探究其机制，研究人员进一步进行了竞争实验和结合分析。结果发现，未甲基化DNA能够有效竞争并抑制切割，而甲基化DNA即使在高浓度下也难以参与竞争；EMSA实验同样显示，甲基化DNA几乎无法与ThermoCas9形成稳定复合物。

这些结果表明，ThermoCas9对甲基化的响应发生在DNA识别早期阶段，即甲基化降低了DNA结合能力进而抑制后续切割，而非直接影响催化过程。

高分辨率结构揭示甲基化敏感性的识别机制

研究团队利用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM），解析了ThermoCas9在不同功能状态下的结构，分辨率最高达到2.2 Å，包括：切割前状态（pre-cleavage，2.8 Å），切割后状态（post-cleavage 2.2Å），单链DNA结合状态（2.5 Å）。整体来看，ThermoCas9的结构框架与已报道的Cas9蛋白基本一致，由负责识别RNA-DNA杂交的REC结构域以及执行DNA切割功能的NUC结构域构成，体现出典型的Cas9分子架构。

在进一步解析ThermoCas9如何“读取”DNA甲基化信息时，研究团队通过高分辨率结构分析，明确了其PAM识别的独特分子机制。与已报道的Cas9蛋白不同，ThermoCas9在PAM识别中呈现出一种严格识别关键碱基对的模式： Arg1035通过一对氢键识别G(-5)，Asp1017与Ser1019从DNA大沟侧共同识别C(5*)，该区域空间高度紧凑，几乎不允许额外化学基团进入。这一结构特征很好地解释了其甲基化敏感性的来源：当C(5*)发生5位甲基化时，新增的甲基基团会产生明显的空间位阻，干扰PAM识别过程，最终抑制ThermoCas9的活性。

从分子机制到疾病模型：ThermoCas9实现甲基化敏感的精准基因编辑

在明确ThermoCas9对甲基化修饰敏感的分子机制后，研究团队发掘了其对不同甲基化图谱的人类细胞进行差异性基因编辑的潜力。

他们先分析了ENCODE数据库中不同细胞系的甲基化数据，发现大约3%–6%的CpG位点在不同细胞之间状态完全相反，这些差异位点广泛分布于启动子、编码区及非编码区，其中包含大量与疾病相关的重要基因。这就带来一个很有意思的可能性：同一段DNA，在不同细胞里，可以被“区别对待”。

基于对DNA元件百科全书（ENCODE）数据库的分析，研究团队选择多个在HEK293（胚胎肾细胞）和HCT116（结直肠癌细胞）中具有不同甲基化状态的基因编辑位点进行验证。实验结果符合预期：ThermoCas9成功靶向编辑两种细胞中均未被甲基化的位点；同时，无法编辑两种细胞中均为甲基化的位点；而在差异性甲基化位点，则表现出明显的选择性编辑，对于同一位点，仅能靶向具有未甲基化表型的细胞系。这与经典的SpyCas9形成了鲜明对比——SpyCas9在所有位点均可进行编辑，不受甲基化状态影响。

基于ThermoCas9的甲基化敏感特性，研究团队还开发了一种结合PCR的甲基化检测策略。利用ThermoCas9对基因组DNA进行甲基化敏感切割，并对位点两侧的DNA片段进行PCR扩增，从而通过PCR结果判断目标位点的甲基化状态。结果表明，当PAM序列中含有5mCpG 甲基化位点，ThermoCas9便无法切割， PCR得以顺利进行。而未甲基化位点则会被特异性切割，使PCR产物减少或消失。这一方法证明ThermoCas9可用于筛选甲基化基因，为基于酶学反应的甲基化检测提供了一种简便的新思路。

为了进一步提升性能，研究团队对ThermoCas9进行定向进化，获得了一个增强型突变体，并且，通过采用mRNA或核糖核蛋白（RNP）递送ThermoCas9，与质粒递送相比编辑效率显著提高，为后续临床转化提供了技术基础。

在应用层面，研究团队测试了ThermoCas9靶向乳腺癌细胞中低甲基化基因的效果。在乳腺癌细胞中，由于DNA甲基化的缺失导致的ESR1过表达是常见的靶向治疗位点。通过对MCF-7（癌细胞）和MCF-10A（正常细胞）细胞基因组进行甲基化EPIC芯片分析，研究团队选择了数个存在甲基化差异性的靶点。利用增强型突变ThermoCas9 进行靶向编辑后，癌细胞中的目标位点被成功编辑，且编辑效率达25%~78%。而在正常细胞中的编辑水平与其甲基化水平相符，显著低于癌细胞。

讨论与展望：开启“表观遗传感知型CRISPR”的新方向

综合生化实验、结构解析与细胞功能验证，该研究证明：ThermoCas9可识别5′-NNNNCNR-3’ PAM序列，而当5位胞嘧啶甲基化（5mC）时，其活性在体外及人类细胞中均被显著抑制。

这项研究最核心的意义在于，Cas9不再只是“识别基因序列”，而开始能够“感知表观遗传学状态”。ThermoCas9所带来的，是一种基于表观遗传信息的选择性编辑能力：它可以根据DNA的甲基化状态决定是否进行切割，从全新的维度实现更精细的调控与更精准的靶向治疗。

https://www.nature.com/articles/s41586-026-10384-z

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