在微生物合成生物学领域，科学家致力于通过理性工程化手段重新编程微生物细胞，赋予其全新的功能以满足多样化需求。然而，这种干预往往扰动宿主原有的代谢网络，带来系统复杂性与不可预测性上升的问题。为应对这一挑战，研究人员逐步发展出一系列“正交”策略，即在微生物内部构建与天然系统相对隔离的遗传、代谢、能量与调控系统。这些系统能够独立于宿主运行，在减少干扰的同时实现更精确的功能控制，为高效、可编程的细胞工厂构建开辟了新路径。
近日，江南大学吴静教授团队在Cell Press旗下期刊《Trends in Biotechnology》发表了题为《Recruiting orthogonal biological systems for engineering microorganisms》的综述文章。该文系统回顾了正交生物学系统在微生物工程中的最新进展，涵盖遗传信息、代谢途径、能量供应与调控网络四个关键层面，并展望了未来如何通过集成化设计推动微生物合成生物学迈向更高效、更可控的新阶段。
在正交遗传系统方面，研究重点围绕DNA复制、转录与翻译三个层面构建独立于宿主的遗传信息处理平台。酵母中的OrthoRep系统利用两个独立复制的质粒实现了目标基因的高突变率连续进化，已成功应用于TrpB等酶的快速演化。类似地，近年来在大肠杆菌中开发的BacORep、EcORep等系统将这种能力引入细菌体系，大幅缩短了进化周期。转录层面的正交系统则以T7 RNA聚合酶为代表，通过改造启动子识别特性，实现与宿主转录系统的隔离。在翻译层面，研究人员通过构建正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA对以及正交核糖体/mRNA对，实现了非天然氨基酸的定点引入，为新型蛋白质合成提供了可能。
正交代谢途径的构建则致力于将目标产物的合成与中心碳代谢解耦，减少与宿主代谢的干扰。代表性策略包括非氧化 glycolysis（NOG）途径，该途径可在不释放二氧化碳的前提下将果糖-6-磷酸高效转化为乙酰辅酶A，提升碳原子利用率。此外，利用非常规底物如木糖、半乳糖醛酸构建的非磷酸化途径，以及基于异构体前体NPP构建的单萜合成模块，均在酵母和大肠杆菌中实现了高效产物积累。在空间层面上，研究还利用天然细胞器如过氧化物酶体，以及人工构建的无膜细胞器（MLO）对多酶途径进行区室化隔离，有效提高了合成效率并减少中间产物毒性。
在正交能量系统方面，研究者致力于开发与天然辅因子隔离的能量载体。通过改造NAD+结构中的AMP部分，获得了一系列半合成或全合成的正交氧化还原辅因子，如NMN+、NCD+等。其中NCD+可在工程菌中积累至5 mM以上，远超天然辅因子浓度。为提升这些辅因子的实用性，研究进一步通过理性设计或生长耦联的高通量筛选策略改造代谢酶，使其能够高效识别并利用这些非天然辅因子。例如，通过多轮饱和突变筛选获得的甲酸脱氢酶突变体，其对NCD+的选择性提高了3700倍，并在连续运行16天的反应中保持高效辅因子循环。
正交调控系统则支撑了更复杂的基因表达与细胞间通信。在胞内层面，基于CRISPR的转录激活与干扰系统可同时、正交调控多个基因，推动复杂代谢通路的优化。同时，人工sigma因子和人工转录因子结合相应启动子，建立了独立于宿主的调控线路。在细胞间层面，研究人员利用不同结构的酰基高丝氨酸内酯构建了正交的种内与种间通信系统。通过设计包含不同信号分子的“捕食者-猎物”菌群系统，实现了种群密度和代谢行为的动态调控，为构建智能微生物群落奠定了基础。
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