随着全球经济和科技的不断发展，食品安全问题更加受到人们的关注。据世界卫生组织估计，全球每年约有6亿 人因摄入受污染食品患病，其中42万 人死亡，造成的经济损失高达1 100亿 美元，这不仅给公共卫生系统带来了巨大的压力，也对社会经济发展构成了持久且严重的威胁。随着全球化贸易的扩大、食品生产技术的革新以及消费者需求的多样化，食品供应链变得更加复杂且多元化，食品中潜在的危害因素也日益增多。食源性有害物不仅仅包括传统意义上的有毒化学物质如农兽药残留、生物毒素、食物过敏原、非法添加剂，还涉及到不断变异的病原微生物、新资源食品潜在危害因子等新兴问题，如何快速、准确地检测这些有害物质成为了食品安全领域的关键技术难题。此外，食品消费周期普遍较短，这对检测技术的时效性、灵敏度与智能化水平提出了更高要求。
针对食源性有害物质的检测，目前主要采用的方法有微生物培养、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用等。这些方法虽然有着较高的准确性和灵敏度，但是在实际应用中通常面临着检测时间长、操作复杂、成本高等问题，难以满足快速筛查和大规模应用的需求。与此同时，基于抗原-抗体特异性结合的免疫检测方法由于灵敏度高、特异性强、操作简便而受到研究人员的广泛关注。近年来，酶联免疫吸附分析（ELISA）、荧光免疫、化学发光免疫以及免疫层析技术等常见免疫分析方法在有害微生物、生物毒素、农药与兽药残留等目标物的检测中得到了广泛的应用，已成为食品安全与环境监测等领域的重要分析手段。然而，现有检测方法多依赖于传统抗体如鼠源单克隆抗体（mAb），其分子质量大、耐受性差，在一定程度上限制了其在复杂检测环境中的应用及发展。例如，很多靶标抗原可能位于空间结构非常狭窄或隐蔽的区域，传统抗体由于体积庞大，其抗原结合片段（Fab）无法有效触及这些位点；另外，mAb轻链和重链之间存在的疏水界面容易受温度影响，导致本应藏在内部的疏水区域暴露并发生非特异性聚集，从而使抗体失活。为克服传统抗体在稳定性、适应复杂检测环境中的局限，近年来，多种替代抗体分子应运而生并取得显著进展。其中，来源于鲨鱼、驼科等动物的纳米抗体由于其分子质量小、亲和力高、稳定性强、易于表达和工程改造等特点，在多个免疫检测领域展现出广泛的应用前景。结合现代传感器技术，纳米抗体能够实现高效快速的检测，正逐步成为食品安全检测的重要工具。
随着纳米抗体在食源性有害物质检测中的研究不断深入，许多研究者已经开发出了一系列基于纳米抗体的检测平台。借助其亲和力高、稳定性强以及易于表达与改造等独特优势，这些检测平台不仅在灵敏度和特异性方面取得了显著提升，同时在检测速度、成本控制及操作便捷性等方面也展现出巨大的优势，成为基于传统抗体免疫方法的有利补充。
华南农业大学食品学院的徐振林*、梁晓敏、刘敏玲等人系统地介绍纳米抗体的结构特性与制备方法，重点阐述其在常见食源性有害物质中的快速、智能化检测的研究进展，并进一步探讨纳米抗体在新兴技术中的潜在优势与挑战，分析其在复杂检测环境中的广阔应用前景及局限性，旨在为突破传统检测方法的局限性、提升纳米抗体技术的应用潜力提供理论支持。
1 纳米抗体的结构特性与制备策略
1.1 纳米抗体的结构特性
1.1.1 分子质量小
纳米抗体是一类来源于鲨鱼、驼科等动物（如羊驼、骆驼）的单域抗体，本质是重链抗体的可变区（VHH），其发现于比利时自由大学的一项偶然研究。1993年，研究人员Hamers-Casterman等在研究驼科动物抗体结构时发现了一种特殊的重链抗体。与传统免疫球蛋白G（IgG）抗体不同，纳米抗体缺失轻链，并且其抗原结合功能完全依赖于重链可变区，相对分子质量约为15 kDa，比传统抗体（约150 kDa）及其Fab段（约50 kDa）要小得多，是已知的最小的抗原结合单位。
1.1.2 稳定性强
与传统的IgG抗体相比，纳米抗体可变结构域内富含二硫键和亲水性氨基酸残基，有助于其在热应激下维持天然构象或在变性后自发复性。以往的研究认为，在互补决定区（CDR）3区的氨基酸数量大于16时，纳米抗体的熔解温度（Tm值）会降低，从而影响整体稳定性。然而当CDR3区与框架区（FR）形成非经典二硫键时，可显著抵消长CDR3的柔性，减少热诱导聚集的发生。有研究表明即使在37 ℃条件下放置1 周，纳米抗体仍能保持完全结合载量。此外，纳米抗体往往可耐受较高浓度的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF），这为其在复杂基质的检测提供了良好的应用基础。
1.1.3 亲和力高
纳米抗体由4 个FR区和3 个CDR区组成，其结构框架包括2 个β折叠，其中一个包含4 个β链，另一个包含5 个β链，CDR区在β链之间形成灵活的抗原结合环（图1）。CDR区是决定抗原识别与结合特异性的关键区域，尤其是CDR3区通常对抗原识别起主导作用，而CDR1和CDR2区更多的是负责协助结合。与传统抗体相比，纳米抗体具有更长的CDR3区，这一结构特征赋予其更大的结合位点多样性和更优的抗原识别能力。这一广泛的结合表位，使其亲和力与常规mAb相当或优于传统mAb，亲和力常数范围可达皮摩尔级别。
1.1.4 易于表达及工程改造
传统的mAb在生产时通常需要大量的哺乳动物以及漫长的筛选和纯化步骤，从而导致了其昂贵的生产成本并限制了其进一步应用。相比之下（表1），纳米抗体的单域结构避免了复杂的组装要求，可在微生物系统（如细菌、酵母、真菌）中表达，显著缩短研发周期、降低生产成本，从而解决抗体规模化生产的瓶颈问题。此外，纳米抗体具有短小的基因序列，便于通过聚合酶链式反应（PCR）扩增、噬菌体展示等分子生物学技术构建表达文库，并实现高效筛选高表达克隆。合成文库技术的应用进一步简化了纳米抗体的开发流程，使其在无需依赖动物免疫的情况下亦可获得具有高亲和力的候选分子，显著降低了筛选与应用的技术门槛。
1.2 纳米抗体的制备策略
纳米抗体的筛选与鉴定技术是其在生物医学、食品安全检测、环境监测等领域应用的关键环节，其在很大程度上依赖于抗体文库的构建。目前常用纳米抗体文库主要分为3 种：免疫文库、天然文库和合成文库。其中，最常用的是免疫文库，通常通过免疫单峰骆驼、美洲驼等动物获得。天然文库是指从未经免疫的骆驼科动物体内直接构建的、以VHH基因序列为基础的抗体文库。由于缺乏体内免疫亲和力成熟步骤，其初始库容与多样性高度依赖于供体动物的血液样本量，只有从库容大、多样性高的文库中才能获得高特异性和亲和力的纳米抗体，或需要经过体外亲和力成熟。随着生物信息学、人工智能和蛋白质工程技术的发展和计算机辅助设计，合成文库已成为优化纳米抗体的重要策略。合成文库是一种通过基因工程技术构建的重组抗体库，与传统的免疫文库不同，合成文库完全通过体外分子设计构建，具有多样性高、可控性强、无动物依赖等优势。它避免了动物免疫的繁琐过程，为纳米抗体的研究开辟了更加高效便捷的路径。
噬菌体展示技术是纳米抗体筛选的核心方法，有着操作简便、成本低、高效等优势，还可免受高温、pH值、变性剂、紫外线和蛋白水解酶等因素的影响，通过构建和筛选高多样性的噬菌体展示文库，可快速获得高亲和力和高特异性的纳米抗体。噬菌体展示技术又称生物淘选，是一种分离靶标结合分子的亲和选择过程。如图2所示，基于噬菌体展示的生物淘选主要包括5 个步骤：第1步是“文库构建”，通过克隆组合DNA序列构建噬菌体文库，并在生物淘选之前完成文库扩增。免疫文库需用相关抗原对骆驼科动物进行免疫，天然文库则省去该步骤。第2步是“噬菌体孵育”，即噬菌体文库与目标分子孵育一段特定时间以使其结合。第3步是“洗涤”，通过重复洗涤去除任何未结合和非目标特异性噬菌体。第4步是“洗脱”，目标结合噬菌体经过低pH值缓冲液的短暂孵育或竞争性洗脱后分离。最后，在第5步“扩增”，洗脱后的噬菌体在大肠杆菌中进行扩增，建立一个新的更具选择性的噬菌体文库，用于下一轮的生物筛选。通常，需要3～5 轮生物淘选分离特异性和亲和力高的目标结合物。通过增加洗涤次数和减少靶分子的量增加每轮生物淘选的严格性，从而去除非特异性噬菌体并分离对靶标具有高亲和力的噬菌体。在生物淘选结束时，用噬菌体ELISA和DNA测序鉴定对靶标具有高亲和力的个体特异性噬菌体。
2 纳米抗体在食源性有害物快速检测中的优势
2.1 高灵敏度：纳米抗体在痕量分析中的应用
在食源性有害物的检测中，灵敏度是评价检测系统性能的关键指标，尤其在处理毒性强、含量低的污染物（如生物毒素、农兽药残留等）时更显重要。在检测中，很多靶标抗原可能位于空间结构非常狭窄或隐蔽的区域，传统抗体由于体积庞大，其Fab段无法有效触及这些位点。相较于传统抗体，纳米抗体的小体积使其能够更充分地接近并识别目标分子上的隐蔽抗原表位，从而显著提升检测灵敏度。此外，纳米抗体较长的CDR3区也赋予了其较高的特异性和亲和力。近年来，多项研究已证实纳米抗体在痕量目标分析中的应用潜力。对部分已报道的纳米抗体免疫分析文献进行总结，发现大部分基于纳米抗体建立的分析方法均具有良好的灵敏度（表2）。例如，针对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的纳米抗体，已成功应用于ELISA和比色/荧光传感平台，能够实现对目标残留物的快速筛查与定量检测。Zhang Yongyi等开发了一种针对百草枯的超灵敏、高特异性和稳定的纳米抗体，并用时间分辨荧光微球对该抗体进行修饰，建立了一种快速比色法，该方法对百草枯的检测限（LOD）为0.009 0 ng/mL，半抑制浓度（IC50）为0.058 8 ng/mL。与传统基于mAb、多克隆抗体（pAb）建立的ELISA方法相比，该方法不仅具有更高的灵敏度和更快的检测速度（8 min），还可对各种复杂基质如血液、尿液、玉米中的百草枯进行检测定量，更好地满足百草枯残留和代谢的检测需求。在另一项研究中，Yang Yuanyuan等从噬菌体文库中筛选到3 株高度特异性纳米抗体，并建立了间接竞争酶联免疫吸附分析（ic-ELISA）用于检测动物尿液中的19-去甲睾酮，在最佳条件下，该方法的IC50为1.03 ng/mL，LOD为0.10 ng/mL。与已报道的基于mAb或pAb相比，该方法具有相当或更高的灵敏度，如pAb的IC50为27 ng/mL或6.41 ng/mL，mAb的IC50为0.55 ng/mL。此外，这些检测方法大多可在数分钟内完成，可满足食品安全现场快速检测的需求。
2.2 高稳定性：复杂食品基质中的可靠识别元件
2.2.1 高温耐受性
纳米抗体的小分子和单域属性赋予了其更为出色的热展开抗性以及变性后重新折叠的能力，这使得其在高温环境下仍能保持良好的构象稳定性和功能活性。Zhang Caixia等通过实验比较了纳米抗体与mAb的热稳定性。研究结果表明，在80 ℃加热10 min后，mAb与抗原的结合能力几乎全部丧失，而纳米抗体在80 ℃加热60 min后仍保留有30%的活性。表3中总结了部分已报道的纳米抗体免疫分析方法，可以发现大部分纳米抗体在85 ℃高温长时间处理后仍可保持结合活性，而其他常规抗体则不可逆地失活。例如，Liu Xing等在开发用于检测谷物中赭曲霉毒素A（OTA）的纳米抗体时，发现该抗体在90 ℃加热75 min后仍保留约25%以上的结合活性。相比之下，常规IgG抗体在80 ℃条件下处理5 min即完全失活。针对黄曲霉毒素的纳米抗体也表现出优于常规抗体的热稳定性。研究表明，在高温条件下孵育1 h后，传统mAb几乎完全失去结合活性，而纳米抗体在相同条件下仍能保留约40%至70%的活性。类似的热稳定特性也在靶向蓖麻毒素的纳米抗体中得以观察。这种显著的热稳定差异凸显了纳米抗体在食品高温加工环境下的广阔应用前景。
2.2.2 强有机溶剂耐受性
在食品安全检测中，为了实现对亲脂性分析物的高效提取，常常需要使用有机溶剂（如甲醇、乙醇、乙腈、丙酮或DMSO等）进行样品前处理。然而，这类溶剂往往会使抗体的构象发生变化或活性丧失。因而在以传统抗体为检测抗体开发的检测体系中，往往需要通过蒸发复溶或者高倍比稀释等操作避免有机溶剂的影响，这不仅增加了操作复杂性，还显著增加了检测周期。相较之下，纳米抗体因其独特的单域结构和高构象稳定性，对多种有机溶剂表现出良好的耐受性，这一优势为将纳米抗体直接应用于有机相提取样品的免疫检测提供了可行性，有效简化了前处理流程，并显著提升了检测的效率与现场适应性。
例如，Zhang Jinru等基于高甲醇和乙腈耐受性的纳米抗体，开发了一种ic-ELISA并用于测定蔬菜和水果样品中的克百威。结果表明，该方法在用有机溶剂对样本进行提取后，不需要经过吹干的步骤，可直接实现对样本中的克百威进行检测，样品的平均回收率在82.3%～103.9%之间，变异系数在10%以内，与超高效液相色谱-串联质谱法之间的相关系数为0.991 3，可满足实际样品的检测要求。He Ting等构建了一种针对AFB1的纳米抗体（Nb26和Nb28），结果显示该抗体在体积分数高达80%的甲醇、丙酮或乙腈存在时依然保持结合活性。基于该抗体开发的竞争性ELISA可直接针对70%甲醇提取液进行分析，无需对样品进行稀释。在针对稻米中稻绿核菌素的研究中，Nb-B15能在50%甲醇和45%乙腈条件下保留大于50%结合活性；在50%乙腈存在下，还能增强抗体的亲和力。这些研究结果如表4所示，表明纳米抗体在高浓度有机溶剂中仍能保持良好的结构稳定性和抗原结合能力，使其可直接应用于有机相提取样品的免疫检测中，显著简化前处理步骤并保证检测结果的准确性与可靠性。值得注意的是，不同纳米抗体对各类有机溶剂的耐受能力存在差异，可能与其特定氨基酸序列所形成的疏水性结构域、内部氢键网络以及疏水核心的紧密程度有关。此外，某些纳米抗体的表面带电性质也可能在极性溶剂环境中起到稳定构象的作用，从而增强其在特定溶剂中的稳定性。这些结构特性共同决定了纳米抗体在有机溶剂中的溶解性与功能保持能力，为其在复杂基质样品中直接开展免疫分析提供了坚实的理论基础和应用潜力。
2.2.3 长期储存稳定性与极端环境耐受性
在食品安全现场检测和应急监测中，快检体系常常面临无冷链储运、长期贮存和环境剧烈波动等挑战。因此，检测系统中所用的生物识别元件必须具备良好的稳定性，能够在非理想条件下长时间保存并保持功能活性。然而，传统抗体结构复杂、对温度和pH值敏感，通常需要冷链保存（2～8 ℃）或冻干处理，否则容易因变性或聚集而失活，这极大地限制了其在实际检测中的应用。相较而言，纳米抗体由于其高度稳定的单域结构，表现出优异的长期储存和极端环境耐受性，成为构建快速检测平台的理想分子工具。Arbabi Ghahroudi等的研究表明，纳米抗体在37 ℃连续孵育60 h仍然保留了80%～100%的原始抗原结合活性。在对金黄色葡萄球菌肠毒素B的研究中，Hughes等筛选获得的纳米抗体SEB-9在室温（约25 ℃）条件下储存两周后，仍保留有约93%的抗原结合活性。这一表现远优于传统抗体，为不依赖冷链的现场应用提供了技术支撑。
2.3 易于工程改造：构建多功能检测平台
纳米抗体凭借其独特的结构特征与生物化学稳定性，展现出良好的分子可塑性，能够通过基因工程手段实现定点突变、多价构建及功能融合等多种改造策略。这些工程化改造不仅有助于提升其亲和力和结构稳定性，还赋予其更丰富的功能特性，从而显著拓展其在快速检测技术中的应用潜力与适应性。如图3所示，Wang Yueqi等通过设计了一种双特异性纳米抗体（BsNb）支架，开发了一种定向固定化ELISA平台（O-ELISA），用于高灵敏度检测肠炎沙门氏菌和副溶血性弧菌。在优化条件下，基于BsNb的O-ELISA对肠炎沙门氏菌和副溶血性弧菌的LOD分别为3.33×103 CFU/mL和6.35×104 CFU/mL，相较于传统被动固定化单特异性纳米抗体的ELISA，其灵敏度分别提高了13.4 倍和13.7 倍。在另一项研究中，Liao Xingrui等通过将纳米抗体与铁蛋白融合，构建了一种24 价纳米笼状结构的沙门氏菌特异性铁蛋白-纳米抗体复合物（Fenobody）。在优化条件下，基于Fenobody的夹心化学发光免疫分析法的LOD为2.94×103 CFU/mL，比传统3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）显色法的灵敏度提高了12 倍。与单价纳米抗体相比，Fenobody的亲和力提高了35 倍，同时保持了良好的热稳定性和特异性。该方法在果汁、火腿肠和蜂蜜等实际样品中的回收率为70.4%～119.4%，变异系数为11.21%。该研究为食源性病原体的高灵敏检测提供了一种新型多价纳米抗体技术平台。
此外，为了实现快速检测平台中识别与信号输出的一体化，纳米抗体常与报告酶（如碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化物酶、荧光素酶等）进行融合表达，形成具有识别与信号转导双重功能的工程融合蛋白。与传统的化学偶联策略相比，融合表达方式在构型一致性、功能保持、生产标准化等方面展现出显著优势。首先，融合表达通过基因工程手段将纳米抗体与酶在编码层面直接连接，确保融合蛋白构象一致、表达稳定，避免了化学偶联中常见的连接位点不确定、产物异质性高的问题。其次，融合蛋白的表达产物在保持纳米抗体结合活性的同时，酶活性也得以稳定表达，因而具备良好的信号响应特性。相比之下，化学偶联过程中可能发生抗原结合位点或酶催化位点被遮蔽或失活的现象，从而影响整体检测性能。此外，融合表达显著简化了检测试剂的制备流程。在传统方法中，抗体与酶的偶联需经过修饰、反应、纯化等多个步骤，而融合表达可直接在大肠杆菌、酵母等系统中实现一体化表达和一步纯化，适合规模化和标准化生产。Wang Xuerou等开发了一种基于Nb28-ALP的磷酸盐荧光传感系统，并将其与磷酸盐触发荧光机制相结合，构建了一个高度灵敏且可靠的OTA荧光免疫分析平台。在优化条件下，该方法表现出良好的检测性能，IC50为0.46 ng/mL，LOD为0.12 ng/mL。曹冬梅等通过免疫羊驼，构建了噬菌体展示的抗AFB1的纳米抗体文库，通过生物筛选将筛选到的特异性结合AFB1的纳米抗体G8与大肠杆菌ALP融合表达，获得同时具有ALP活性和AFB1结合活性的融合蛋白G8-AP，建立检测AFB1的一步ELISA法。该一步法ELISA的IC50值为19.8 ng/mL，线性范围为4.3～92 ng/mL，LOD为2.6 ng/mL。由此可见，纳米抗体与酶的融合表达不仅克服了传统化学偶联方法存在的局限性，还显著提升了检测系统的功能集成度、构建效率与现场适用性，为高性能食品安全快速检测平台的开发提供了重要技术支撑。
2.4 纳米抗体与智能化传感平台的结合
随着食品安全检测需求的多样化和复杂化，传统实验室方法已难以满足快速、便携、高通量的要求，由此，智能化检测平台应运而生，其集成了微型传感器、信息处理单元和信号读出系统，可实现自动化、可视化，甚至远程操控与数据传输，在食品安全检测领域展现出广阔的应用前景。纳米抗体凭借其优异的稳定性、小分子结构与工程改造潜力，与生物电子传感、生物纳米平台等前沿技术的融合，正在推动检测技术向智能化、集成化迈进。一方面，与传统抗体相比，纳米抗体的分子质量小、稳定性强、对有机溶剂耐受性高等特性，更适用于复杂环境下的现场检测。另一方面，其单域结构便于与金属纳米材料、量子点或酶分子等偶联，也可通过基因工程手段与功能蛋白融合表达，便于构建多功能识别探针。纳米抗体的这些特性显著提升了智能化传感平台的响应速度、信号强度和稳定性，使其更适合集成于便携设备、手机读数系统或可穿戴检测装置中，实现“快速识别-即时反馈-数据联通”的智能检测流程。
2.4.1 基于智能手机的传感策略
随着经济的发展和科技的进步，智能手机的应用越来越广泛。与传统的经典手机相比，智能手机具有质量轻且便于携带、功能强大、渗透率高、用户范围广等特点，且具有全面的功能和学习能力，不断更新并快速适应用户的需求。最重要的是，与大型设备相比，基于智能手机的微型仪器成本更低、检测速度更快、访问渠道更广。利用智能手机的内置功能模块，其通常用作控制器、分析仪和显示器，以实现快速、实时的监测，这可以大大简化检测系统的设计并降低检测系统的成本。一方面，可通过将智能手机作为探测器实现对样品进行拍照或记录以形成图像；另一方面，可将智能手机用作仪器接口与微型仪器相连，连接到微型仪器的手机既不需要耦合装置，也不需要摄像头，只需使用智能手机强大的计算能力即可。尽管基于智能手机的便携式检测系统在食品分析领域发展迅速，并广泛采用mAb实现高灵敏检测（图4），但将纳米抗体整合至此类平台的相关研究仍较为稀缺，亟需深入探索其在智能检测技术中的应用潜力。Xie Xiaoxia等基于纳米荧光素酶标记的纳米抗体建立了一种比率式生物发光免疫传感器，并在智能手机的辅助下实现OTA的快速现场检测。尽管该传感器可在一定程度上实现肉眼的视觉检测，但无法区分细微的颜色变化，容易造成个体判断的偏差，借助智能手机实现RGB的解析可实现定量检测。使用酶标仪检测的LOD为0.98 ng/mL，而智能手机读出的LOD也达1.89 ng/mL，性能上接近实验室设备，为实现移动端、云端的数字化智能检测提供了基础。在另一项研究中，Lu Shenjunjie等基于智能手机的图像识别和处理功能，构建了一种快速、直观、现场可操作的新城疫病毒检测系统。通过智能手机图像传感器实现了对检测结果的分析，并将检测结果数字化，从而大大缩短了检测所需的时间。这种检测方法方便简单，无需专业培训，特别是云服务器上的管理系统可以有效地促进数据的共享，使检测数据能够实时监控。
2.4.2 基于“识别-放大-输出”一体化模块的传感策略
在传感器构建过程中，纳米抗体可通过His-tag、Strep-tag等形式实现定向固定，避免传统抗体随机吸附所导致的识别位点遮蔽问题，从而增强检测信噪比与重复性。更重要的是，纳米抗体极易通过分子工程手段与酶、荧光蛋白、量子点或导电聚合物融合表达，构建“识别-放大-输出”一体化功能模块，极大促进其在生物传感器、电化学传感器、可穿戴监测设备等先进检测平台中的集成应用。如Su Benchao等通过构建两种OTA特异荧光纳米抗体，即纳米抗体融合在sfGFP的羧基末端（SGFP-Nb）或氨基末端（Nb-SGFP），选择荧光性能较好的SGFP-Nb作为OTA的示踪剂，通过荧光共振能量转移（FRET）开发基于荧光纳米抗体的纳米传感器FN-Nanosens。在优化条件下，FN-Nanosens的LOD为5 pg/mL，线性检测范围为5～5 000 pg/mL，且该传感器在具有各种复杂基质环境的谷物的回收实验中显示出良好的准确性和可重复性（图5）。Xie Xiaoxia等使用先前筛选的OTA特异性纳米抗体，将其与NanoLuc酶的大片段（LgBiT）融合，生成Lg-nanobody（NLg），同时将小片段（SmBiT）标记在OTA-BSA共轭物（OSm）上，基于此构建了一种均相传感平台生物发光免疫传感器（NBL-Immunosens）。NBL-Immunosens无需洗涤即可在5 min完成对OTA的检测，LOD为0.01 ng/mL，线性范围为0.04～2.23 ng/mL。Li Shijie等以纳米抗体作为捕获抗体，mAb作为检测抗体，构建了一种基于纳米抗体的“荧光光热”生物传感器用于高特异性和高灵敏度的β-乳球蛋白检测。在荧光模式下，检测范围为0.1～100 ng/mL，LOD为0.034 ng/mL；在光热模式下，检测范围为0.1～100 ng/mL，LOD为0.075 ng/mL，且该免疫传感器在巴氏杀菌牛奶、超高温灭菌牛奶、牛奶饮料和绿茶中均具有良好的适用性。综上所述，纳米抗体因其优异的稳定性、易于工程化修饰及良好的平台适配性，正成为新一代食品安全生物传感器的关键构件。
2.4.3 基于表面等离子体的传感策略
表面等离子体共振（SPR）生物传感器通过检测金属-介质界面处表面等离子体波的变化，实时监测生物分子相互作用导致的折射率改变。SPR是一种高灵敏度的光学传感技术，其原理基于入射光与半透明贵金属层或芯片中的自由电子的相互作用，从而实现对金属-介电界面有效折射率的微小变化的实时监测（图6）。根据等离子体激发机制和传感结构的不同，SPR可分为传统SPR和局域表面等离子体共振（LSPR）两大类。传统SPR通常基于Kretschmann或Otto光学耦合结构，在金属薄膜（通常为几十纳米厚）表面激发表面等离子体波，适用于检测较大分子或复杂体系的结合行为。相比之下，LSPR则发生在金属纳米颗粒（如金纳米棒、纳米壳）表面，具有极强的局部电磁场增强效应，使其在检测低分子质量目标、信号放大和芯片小型化方面具有独特优势。此外，还有基于光纤、波导、成像型等多种SPR衍生技术，不断拓展其检测能力与应用场景。1982年，瑞典科学家Liedberg团队将SPR用于生物分子相互作用检测，通过固定抗体成功检测抗原，开创了SPR在生物化学中的应用。该技术作为一种无需标记、实时监测生物分子相互作用的光学传感方法，近年来在食品安全检测领域展现出显著优势，尤其在食源性致病菌、生物毒素及过敏原等食源性有害物的快速、高灵敏检测方面展现出巨大的应用潜力和发展前景。例如，Wang Peng等报道了副溶血性弧菌的噬菌体展示纳米抗体库，并提出了一种基于硫醇化M13噬菌体展示的纳米抗体（phage-Nb）的一步无标记比色策略，用于副溶血弧菌的高灵敏度检测。该方法可在100 min内完成检测，视觉LOD为104 CFU/mL，定量LOD为103 CFU/mL。在另一项工作中，Chen Pengyu等开发了一种基于纳米抗体诱导的金纳米颗粒（AuNPs）聚集的色谱型免疫传感方法，用于阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）的即时检测。当纳米抗体与目标细菌结合时，会发生空间阻碍，从而阻止AuNPs进一步聚集，这种表面等离子共振特性的改变导致了可见光颜色的变化。该方法无需进行DNA提取或PCR扩增，全程可在20 min内完成，视觉LOD为103 CFU/mL，定量检出限为136 CFU/mL，这种免标记、操作简便的平台显示出广泛的现场检测和食品监控应用潜力。
3 结语
纳米抗体自发现以来凭借其独特的优势，在快速检测领域中展现了独特的应用潜力。相较于传统的抗体，纳米抗体具有分子质量小、稳定性高、亲和力强、特异性好以及易于工程改造等优点。目前，基于抗体-抗原特异性结合的免疫分析方法也受到了研究人员和市场的青睐，纳米抗体的小尺寸使其更易接近并结合隐藏的抗原表位，从而显著提升检测的灵敏度和信噪比；其优异的热稳定性和有机溶剂耐受性为复杂食品基质中的稳定检测提供了可能；其高度可表达性和良好的可修饰性也为快速检测方法的规模化制备和功能化设计提供了重要基础。
尽管纳米抗体相较于传统抗体在灵敏度、稳定性以及工程改造潜力等方面具备显著优势，但其小尺寸在带来优势的同时，也成为其进一步推广应用的瓶颈之一。首先，在异相偶联固定化过程中，纳米抗体由于分子质量较小、结构紧凑，其活性位点容易在随机偶联时被遮蔽或发生构象取向不当，导致结合活性下降；其次，在侧流免疫层析试纸等快速检测平台中，纳米抗体的低分子质量在层析过程中易受“层析前沿效应”影响，导致结合区域不均、信号衰减，进而影响检测灵敏度与可重复性；此外，在ELISA体系中，纳米抗体由于仅含单一抗原结合域，可识别表位数量有限，导致其可配对的检测二抗选择受限，从而制约双抗夹心模式的灵敏度与动态范围。未来，随着纳米抗体结构导向改造、界面偶联化学、微流控与智能传感材料等多学科技术的融合，纳米抗体有望在食品安全快速检测中实现从“单靶高灵敏识别”向“多靶广谱智能识别”的跨越。同时，结合机器学习算法对信号图像进行解析及现场实时判读，也将进一步推动纳米抗体在食品安全监测、环境毒素检测及公共卫生防控等领域的智能化应用与产业化发展。
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徐振林，华南农业大学食品学院，院长/教授/博士生导师。主要从事食品安全与营养科研教学工作，承担国家自然科学优秀青年基金，入选全国农业科研杰出人才、广东省特支计划科技创新领军人才等；以第一作者或通信作者发表SCI论文100多篇，入选全球前2%顶尖科学家榜单；主持获得广东省科技进步一等奖1 项，中国食品工业协会科学技术奖一等奖1 项，参加获得国家科技进步二等奖、教育部技术发明一等奖等多项；现任畜禽产品精准加工与安全控制技术国家地方联合联合工程研究中心副主任、广东省食品质量安全重点实验室常务副主任、广东省广东省食品安全学会副会长、广东省食品学会常务理事、Food Safety and Health副主编、International Journal of Food Science 编委等。
引文格式：
徐振林, 梁晓敏, 刘敏玲, 等. 基于纳米抗体的食源性有害物快速智能化检测研究进展[J]. 食品科学, 2025, 46(23): 1-12. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250731-250.
XU Zhenlin, LIANG Xiaomin, LIU Minling, et al. Nanobody-based strategies for rapid and intelligent detection of foodborne contaminants: progress and perspectives[J]. Food Science, 2025, 46(23): 1-12. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250731-250.
实习编辑：王雨婷；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
为汇聚全球智慧共探产业变革方向，搭建跨学科、跨国界的协同创新平台，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，西南大学、 重庆市农业科学院、 重庆市农产品加工业技术创新联盟、重庆工商大学、 重庆三峡科技大学 、西华大学、成都大学、四川旅游学院、北京联合大学、 中国-匈牙利食品科学“一带一路”联合实验室（筹）、 普洱学院 共同主办 的“ 第三届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会 ”， 将于2026年4月25-26日 （4月24日全天报到） 在中国 重庆召开。
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为系统提升我国食品营养与安全的科技创新策源能力，加速科技成果向现实生产力转化，推动食品产业向绿色化、智能化、高端化转型升级，由北京食品科学研究院、中国食品杂志社《食品科学》杂志（EI收录）、中国食品杂志社《Food Science and Human Wellness》杂志（SCI收录）、中国食品杂志社《Journal of Future Foods》杂志（ESCI收录）主办，合肥工业大学、安徽农业大学、安徽省食品行业协会、安徽大学、合肥大学、合肥师范学院、北京工商大学、中国科技大学附属第一医院临床营养科、安徽粮食工程职业学院、安徽省农科院农产品加工研究所、安徽科技学院、皖西学院、黄山学院、滁州学院、蚌埠学院共同主办的“第六届食品科学与人类健康国际研讨会”，将于 2026年8月15-16日（8月14日全天报到）在中国 安徽 合肥召开。
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