2026年1月6日，McMaster University Gregory R. Steinberg、Dongdong Wang 团队联合 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Scott L. Friedman 等，在Cell Metabolism（中科院生物学1区，TOP期刊，IF=30.9）发表题为“Dual inhibition of ACLY and ACSS2 by EVT0185 reduces steatosis, hepatic stellate cell activation, and fibrosis in mouse models of MASH”的研究论文。
该研究围绕代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）中“脂肪变性—肝星状细胞活化—肝纤维化”的病理链条展开，系统评价了双重抑制 ACLY 和 ACSS2 的小分子化合物 EVT0185 对 MASH 及肝纤维化的干预作用。研究发现，EVT0185 不仅能够降低血清和肝脏甘油三酯、改善胰岛素抵抗和肝脂肪变性，还能在多种 MASH 小鼠模型中显著减轻肝纤维化，并且这一抗纤维化作用并不完全依赖体重下降或脂肪变性改善。机制上，EVT0185 通过抑制乙酸经 ACSS2 参与乙酰辅酶A代谢及胆固醇合成，削弱 TGFβ1 诱导的肝星状细胞活化、胶原生成和细胞增殖。空间转录组、单细胞 RNA 测序、人肝切片及原代人肝星状细胞实验进一步表明，ACLY/ACSS2 双靶点干预能够同时作用于肝细胞脂质代谢和肝星状细胞纤维化程序，为 MASH 及代谢相关肝纤维化提供了一种兼具改善代谢、减少脂肪沉积和抗纤维化潜力的新型治疗策略。
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【摘要】
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的特征是脂肪变性、炎症以及由肝星状细胞（HSC）活化驱动的纤维化。乙酰辅酶A是从头脂肪生成（DNL）和胆固醇合成的核心底物，它既可由柠檬酸经ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）生成，也可由乙酸经乙酰辅酶A合成酶2（ACSS2）生成。本文证明，ACLY和ACSS2的双重抑制剂EVT0185能够降低血清和肝脏甘油三酯、改善胰岛素抵抗并减轻纤维化。EVT0185在体内和体外均可直接抑制HSC活化；空间转录组学和单细胞RNA测序显示，经ACSS2介导的乙酸代谢以及胆固醇合成受到抑制，是产生该表型的关键驱动因素。EVT0185还可抑制人肝切片中的从头脂肪生成，并阻断TGFβ1诱导的原代人HSC活化。这些发现表明，通过同时抑制ACLY和ACSS2来靶向胆固醇与乙酸代谢，可能成为治疗MASH和肝纤维化的一种有前景的治疗策略。
01
研究背景及科学问题
肥胖、胰岛素抵抗和血脂异常是代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）发生发展的主要危险因素。MASH是一种进展性肝病，可进一步导致肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。MASH从脂肪变性进展为具有临床意义的肝病，主要由肝星状细胞（HSC）的活化推动。在健康肝脏中，HSC负责储存维生素A并维持肝脏结构；但在代谢应激和炎症环境下，HSC会转分化为具有增殖能力的肌成纤维细胞样细胞，分泌细胞外基质（ECM），从而推动纤维化。尽管近期已有靶向甲状腺激素受体β（THRβ）的激动剂（如resmetirom）和靶向胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）的激动剂（如semaglutide）获批用于MASH治疗，但与安慰剂对照相比，只有约四分之一患者在纤维化组织学表现上出现改善。这一结果可能反映出HSC并不表达THRβ和GLP-1R。因此，能够同时靶向肝细胞脂肪变性和HSC活化的策略，可能使更广泛的患者获益。
MASH的一个典型特征是从头脂肪生成（DNL）增强，即由胞质乙酰辅酶A合成脂肪酸。在这一通路中，乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和脂肪酸合酶（FASN）生成棕榈酸（16:0），随后可被硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）进一步修饰，生成棕榈油酸和油酸等单不饱和脂肪酸，并由二酰甘油酰基转移酶2（DGAT2）整合进入甘油三酯。AMP活化蛋白激酶（AMPK）对ACC的磷酸化和抑制，或者对ACC、FASN、SCD1和DGAT2进行遗传或药理学抑制，均已被证明可在MASH临床前模型中降低脂肪变性、炎症和纤维化。DNL增加还会使HSC对促纤维化信号更加敏感；药理学抑制DNL则可减少培养细胞中的HSC活化。然而，在晚期纤维化临床前模型中的研究显示，将ACC抑制剂与过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）激动剂或resmetirom联合使用，并不能进一步降低纤维化。与此一致的是，2b期研究中将DGAT2抑制剂与ACC抑制剂联合使用，虽然意在缓解ACC抑制所引起的血清甘油三酯升高，但并未带来具有临床意义的MASH和纤维化改善。这些数据表明，尽管DNL抑制剂在临床前模型中可显著降低脂肪变性，并能在培养细胞中减少HSC活化，但若要降低临床人群中的纤维化，可能还需要靶向其他代谢程序。
除脂肪酸外，胞质乙酰辅酶A也是胆固醇合成的主要结构单元。乙酰辅酶A主要通过两条途径生成：一是由柠檬酸经ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）生成；二是由乙酸经乙酰辅酶A合成酶2（ACSS2）生成。胆固醇升高与MASH纤维化发生密切相关，近期研究还发现，携带PNPLA3 I148M变异的人群胆固醇水平也更高。从机制上看，胆固醇可激活HSC，并增强HSC对TGFβ1的敏感性；这一效应可能通过肝细胞中转录调节因子TAZ/WWTR1被激活，进而促使印度刺猬因子（IHH）分泌并激活HSC来实现。在MASH患者中，ACLY和ACSS2表达均上调。在MASH小鼠模型中，肝细胞ACLY的遗传性抑制对脂肪变性的影响并不一致：有研究显示脂肪变性降低，也有研究显示无影响，甚至出现升高。相比之下，在小鼠模型中使用bempedoic acid（BA）处理可降低MASH；该药物抑制ACLY并激活小鼠肝细胞中含AMPKβ1的异源三聚体，而其作用并不依赖肝细胞ACLY活性。抑制肝细胞ACLY活性的一个典型现象，是ACSS2表达上升；ACSS2可清除乙酸以维持DNL所需乙酰辅酶A供应。这一点可能具有重要临床意义，因为乙醇可转化为乙酸，而MASH患者门静脉中的乙醇水平显著升高，提示单独抑制ACLY在该临床人群中可能效果有限。值得注意的是，近期有研究发现，在肝细胞中遗传性删除ACLY和ACSS2并不能降低小鼠脂肪变性，原因可能与PPARα活性和脂肪酸氧化下降有关。与之相反，在本文修订期间发表的一项研究发现，使用AAV8驱动的短发夹RNA敲低肝细胞中的ACLY和ACSS2，可提高PPARα水平并降低小鼠脂肪变性和MASH。虽然这仍属推测，但不同研究间相反的结果，可能源于完全遗传抑制与shRNA介导的部分抑制之间存在不同反应。药理学同时抑制肝细胞以及HSC中的ACLY和ACSS2会产生何种影响，目前尚不清楚。
EVT0185是一种新近描述的ACLY和ACSS2抑制剂，可抑制肝细胞DNL，并通过提高肿瘤免疫原性，在肝细胞癌临床前模型中降低肿瘤负荷。EVT0185的抑制活性依赖于脂肪酰辅酶A合成酶SLC27A2将其转化为EVT0185-CoA。EVT0185对血糖控制、血脂异常、MASH、肝纤维化和HSC活化的影响此前尚未得到阐明。在本研究中，我们发现EVT0185可抑制肝脏脂肪变性、MASH、胰岛素抵抗和肝纤维化，并可在体内和体外直接抑制HSC活化。其对HSC活化的抑制作用并不依赖脂肪变性下降；在葡萄糖和乙酸存在时，该作用具有细胞自主性，并需要SLC27A2、ACLY和ACSS2参与，同时可被胆固醇前体甲羟戊酸内酯所阻断。这些数据表明，乙酸、ACSS2和胆固醇在培养细胞中驱动HSC活化方面具有关键作用，也提示EVT0185对该通路的拮抗不仅能够降低脂肪变性，还能有效减轻肝纤维化。
02
重要发现及亮点
EVT0185在室温饲养的饮食诱导小鼠模型中改善胰岛素敏感性并降低MASH，且不升高血浆甘油三酯（图1，图S1）
来自Taconic Biosciences的饮食诱导肥胖MASH（DIN-MASH）小鼠，从6周龄开始喂食高脂（40%热量）、高果糖（20%热量）和高胆固醇（2%热量）饮食，即Gubra-Amylin NASH（GAN）饮食，持续20周。随后根据体重、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，将小鼠随机分为两组（图S1A–S1C）。该模型已被证明能够较好地模拟人类MASH的转录组特征。随机分组后，小鼠每日经口灌胃给予载体或EVT0185，持续5周（图1A）。与载体对照组相比，EVT0185处理可防止体重增加（图S1D），降低口服葡萄糖耐量试验（OGTT）后的血糖水平（图1B），并通过腹腔胰岛素耐量试验（ITT）显示胰岛素敏感性得到改善（图1C）。这些葡萄糖耐量和胰岛素敏感性的变化，早于两组体重差异出现；体重差异仅在治疗5周后达到显著。与胰岛素敏感性改善一致，终点时禁食4小时测得的血浆葡萄糖水平在两组间无差异（图1D），而EVT0185处理组的血浆胰岛素水平（图1E）和胰岛素抵抗稳态模型评估（HOMA-IR）评分更低（图1F）。为探究体重增加轻度下降的潜在机制，研究者在体重差异出现前（第3周）使用代谢笼评估能量平衡变化，发现与载体对照组相比，EVT0185不影响食物摄入（图S1E）、能量消耗（图S1F）或呼吸交换率（图S1G），提示可能存在其他机制。
图1. 在喂食GAN饮食并于室温饲养的小鼠中，EVT0185改善胰岛素敏感性、MASH和纤维化，且不升高血浆甘油三酯
（A）DIN-MASH研究设计（载体组 n = 9；EVT0185组 n = 10），使用BioRender绘制。
（B）口服葡萄糖耐量试验（OGTT）中记录的禁食血糖值及相对曲线下面积（AUC）。
（C）胰岛素耐量试验（ITT）中记录的禁食血糖值及相对AUC。
（D–F）（D）禁食血浆葡萄糖、（E）胰岛素、（F）计算得到的HOMA-IR。
（G–L）（G）血浆ALT、（H）AST、（I）FFA、（J）胆固醇、（K）甘油三酯、（L）酮体。
（M）代表性肝脏图片。
（N）肝脏甘油三酯。
（O）代表性肝脏H&E染色图像。比例尺：200 μm。
（P）组织学评分（脂肪变性、气球样变、炎症和MASLD活动）。
（Q）代表性肝脏PSR染色图像。比例尺：200 μm。
（R）3区窦周纤维化评分。
（S）PSR阳性面积百分比。
数据以均值±SEM表示。显著性检验采用非配对t检验、Mann-Whitney检验（组织学评分），或双因素ANOVA后接Sidak检验（OGTT、ITT）。n.s.表示不显著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
EVT0185降低了血浆ALT、AST、游离脂肪酸（FFA）和胆固醇，但不影响甘油三酯（图1G–1K）。EVT0185使血浆酮体升高约4倍（图1L）。EVT0185处理组小鼠的肝脏外观看起来脂肪变性减少（图1M），生化分析也证实肝脏甘油三酯降低（图1N）。协方差分析显示，EVT0185引起的甘油三酯下降与体重无关。对H&E染色肝组织切片进行组织学评分发现，与载体对照组相比，EVT0185处理组小鼠的脂肪变性、炎症、气球样变和代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）活动评分（MAS）均降低（图1O、1P）。对苦味酸天狼星红（PSR）染色肝切片分析显示，EVT0185处理组的窦周纤维化评分改善（图1Q、1R），PSR阳性面积降低约50%（图1S）。总体而言，这些数据表明，在喂食GAN饮食26周的小鼠中，EVT0185能够降低胰岛素抵抗、血浆胆固醇、MASH和纤维化，且不会升高血浆甘油三酯。
另一种快速建立MASH和肝纤维化的模型，是在1周内给小鼠喂食含60%高脂、1.25%胆固醇和0.5%胆酸的饮食，并在饮水中加入2%的2-羟丙基β-环糊精（HFCC + CDX饮食）。完成1周饮食干预后，小鼠被随机分配至载体组或EVT0185组；另设一组普通饲料喂养小鼠并给予载体，作为健康对照（图S1H）。与载体相比，EVT0185不改变体重，也不改变血浆ALT、AST或甘油三酯水平，但可降低血浆低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、C反应蛋白（CRP）和血清淀粉样蛋白A（SAA），并升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）（表S1）。肝脏组织学评估显示，与载体处理的HFCC + CDX小鼠相比，EVT0185降低了脂肪变性（图S1J）、炎症（图S1K）和MASLD活动评分（图S1L），并使这些指标降至与健康普通饲料对照组无显著差异的水平。用于显示胶原沉积的天狼星红（SR）肝染色显示，纤维化评分（图S1N）和SR阳性面积（图S1O）均下降。与载体对照组相比，EVT0185还降低了α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性面积；α-SMA是HSC活化的标志（图S1P、S1Q）。EVT0185还降低肝脏FFA和胆固醇（图S1R、S1S）。与组织学上炎症和纤维化降低一致，EVT0185降低了全肝中若干炎症标志物（Il1b、Ccl2、Il6、Nfkb1、Tlr4和Tnfα）以及纤维化标志物（Tgfβ1和Col1a1）的mRNA表达（图S1T、S1U）。因此，在这一快速饮食诱导MASH模型中，EVT0185治疗可降低肝脂肪变性、炎症和纤维化，同时降低血浆LDL-C和CRP/SAA。
EVT0185在两个热中性MASH小鼠模型中降低MASH和胰岛素抵抗（图2）
将雄性小鼠饲养于热中性环境（29°C），并喂食高脂（40%）、高果糖（20%）以及含生理相关水平胆固醇（0.01%）的MASH饮食，能够模拟人类MASH的时间进程、病理学和转录组特征。该模型称为热中性MASH（TN-MASH）模型，不同于其他在室温下饲养小鼠并通过高胆固醇饮食诱导肝细胞损伤的MASH模型，例如前述DIN-MASH模型（GAN饮食）或HFCC + CDX饮食模型。这一区别很重要，因为热中性饲养可降低静息能量消耗，并消除诱导纤维化时对高水平膳食胆固醇的需求；高胆固醇饮食会抑制胆固醇合成，而胆固醇合成通路在人类MASH中通常上调。研究者在TN-MASH小鼠中完成了两项实验。
在实验1中，小鼠2周龄时注射二乙基亚硝胺（DEN）以促进肿瘤发生；10周龄时转入热中性环境并喂食高脂高果糖饮食，直至32周龄，随后给予载体或EVT0185处理4周（图2A）。EVT0185显著降低了肿瘤负荷。载体组和EVT0185组体重无差异。EVT0185降低了血浆葡萄糖（图2B）、胰岛素（图2C）和ALT（图2D），并升高血浆酮体（图2E）。对H&E染色肝切片进行组织学检查发现，EVT0185降低了脂肪变性和气球样变（图2F、2G），但不影响炎症，最终使MASLD活动评分降低（图2G）。EVT0185还降低了3区窦周纤维化（图2H、2I）和PSR阳性面积（图2J）。
图2. EVT0185在两个热中性MASH小鼠模型中降低MASH和胰岛素抵抗（A）TN-MASH研究设计（每组 n = 12），使用BioRender绘制。
（B–E）（B）血浆葡萄糖、（C）胰岛素、（D）ALT、（E）酮体。
（F）代表性肝脏H&E染色和气球样变图像（橙色箭头）。比例尺：100 μm。
（G）组织学评分（脂肪变性、气球样变、炎症和MASLD活动）。
（H）代表性肝脏PSR染色图像。比例尺：200 μm。
（I）3区窦周纤维化评分。
（J）PSR阳性面积百分比定量。
（K）慢性TN-MASH研究设计（每组 n = 7），使用BioRender绘制。
（L–O）（L）血浆ALT、（M）胆固醇、（N）甘油三酯、（O）酮体。
（P）代表性肝脏H&E染色和气球样变图像（橙色箭头）。比例尺：100 μm。
（Q）组织学评分（脂肪变性、气球样变、炎症和MASLD活动）。
（R）代表性PSR染色图像。比例尺：200 μm。
（S）3区窦周纤维化评分。
（T）PSR阳性面积百分比定量。
数据以均值±SEM表示。显著性检验采用非配对t检验或Mann-Whitney检验（组织学评分）。n.s.表示不显著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
在实验2中，小鼠未注射DEN，但接受相同MASH饮食并在热中性环境中饲养72周，形成慢性TN-MASH模型，随后给予载体或EVT0185处理4周（图2K）。EVT0185降低了肿瘤负荷。EVT0185不影响体重，但降低血浆ALT（图2L）和胆固醇（图2M），不影响血浆甘油三酯（图2N），同时升高酮体（图2O）。H&E染色肝切片组织学检查显示，EVT0185降低脂肪变性、气球样变、炎症和MASLD活动评分（图2P、2Q）。PSR染色分析显示，EVT0185降低3区窦周纤维化（图2R、2S）和PSR阳性面积（图2T）。这些数据说明，在喂食高脂高果糖饮食并处于热中性环境的小鼠中，EVT0185可降低血糖和血浆胰岛素，并减轻肝脂肪变性和纤维化，且不会升高血浆甘油三酯。
EVT0185在FAT-MASH小鼠模型中逆转纤维化并降低血清甘油三酯（图3A–3G，图S2）
FAT-MASH模型从6周龄开始给雄性C57BL/6J小鼠喂食高脂（40%）和高胆固醇（2%）饮食（西方饮食），并在饮水中加入葡萄糖和果糖（糖水），同时每周腹腔注射低剂量四氯化碳（CCl4）。该处理可诱导明显的肝脂肪变性、炎症和纤维化，并具有许多人类MASH的病理学和转录组特征。随后，小鼠在继续维持西方饮食并接受CCl4注射的同时，给予载体或EVT0185处理11周（图3A）。与载体对照组相比，EVT0185不影响体重、肝脏或脾脏重量、血清ALT或胆固醇（表S2）。EVT0185降低了肝脏和血清甘油三酯（图3B、3C）。H&E染色肝切片的组织学分析显示，EVT0185降低脂肪变性、气球样变和炎症评分，从而使MASLD活动评分整体下降约4分（图3D、3E）。关键的是，与载体相比，EVT0185使PSR阳性面积降低超过50%；与治疗开始前（基线）观察到的纤维化水平相比，降低了38%（图3F、3G）。羟脯氨酸是胶原的重要组成部分，可作为胶原沉积和纤维化的指标；与载体相比，EVT0185也降低了羟脯氨酸水平（图S2A）。这些数据表明，在FAT-MASH模型中，EVT0185可逆转MASH和纤维化，并同时降低血清甘油三酯。
图3. EVT0185在FAT-MASH和CCl4处理小鼠中降低纤维化，该作用不依赖脂肪变性降低
（A）FAT-MASH研究设计（基线 n = 5，载体组 n = 10，EVT0185组 n = 10，除非另有说明），使用BioRender绘制。
（B）肝脏甘油三酯。
（C）血清甘油三酯。
（D）代表性肝脏H&E染色图像。比例尺：200 μm。
（E）组织学评分（脂肪变性、气球样变、炎症和MASLD活动）。
（F）代表性肝脏PSR染色图像。比例尺：400 μm。
（G）PSR阳性面积定量。
（H）尿柠檬酸/肌酐比值（载体组 n = 5，EVT0185组 n = 5）。
（I）CCl4-普通饲料研究设计（每组 n = 4–10），使用BioRender绘制。
（J）代表性肝脏PSR染色图像。比例尺：200 μm。
（K）PSR阳性面积百分比定量。
（L）代表性肝脏α-SMA染色图像。比例尺：200 μm。
（M）α-SMA阳性面积。
数据以均值±SEM表示。显著性检验采用非配对t检验、Mann-Whitney检验（组织学评分），或单因素ANOVA后接Dunnett事后检验。n.s.表示不显著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
EVT0185增加尿柠檬酸（图3H，图S2B–S2C）
在上述MASH模型中，EVT0185同时降低了血浆葡萄糖和胰岛素，以及循环和肝脏甘油三酯。这与ACC抑制剂的观察结果形成鲜明对比：ACC抑制剂能够降低肝脏甘油三酯，却会升高血清甘油三酯。在DIN-MASH模型中，EVT0185降低体重增加，且该作用与食物摄入或能量消耗下降无关。那么，哪些机制可能介导这些效应？ACLY抑制会导致肝脏柠檬酸增加，而ACC抑制则会导致乙酰辅酶A增加。不同于乙酰辅酶A不能跨越许多细胞类型的细胞膜，柠檬酸可通过柠檬酸转运蛋白由肝细胞和肾近端小管细胞分泌。因此，研究者推测，小鼠接受EVT0185处理后，柠檬酸可能被排入尿液。与这一假设一致，在长期接受EVT0185治疗的FAT-MASH小鼠中，尿柠檬酸/肌酐比值较载体组升高（图3H）。为进一步确认这一结果，研究者给喂食普通饲料的健康C57BL/6J小鼠给予EVT0185，并在首次给药后24小时和6天测定尿柠檬酸/肌酐比值。治疗24小时后，载体组与治疗组无差异（图S2B）；但治疗6天后，EVT0185处理组的柠檬酸/肌酐比值高于载体组（图S2C）。这些数据表明，EVT0185可增加小鼠尿液中的柠檬酸/肌酐比值，这一机制可能对防止血清甘油三酯升高具有潜在重要性。
EVT0185在无脂肪变性的小鼠模型中降低纤维化进展（图3I–3M，图S2）
为评估EVT0185是否能够在不依赖脂肪变性降低的情况下直接抑制HSC活化，研究者在C57BL/6J小鼠中每周3次注射CCl4，持续3周，同时喂食普通饲料。这一方案已知可诱导HSC活化和增殖，但不会诱导脂肪变性。与此同时，小鼠每日经口灌胃给予载体、bempedoic acid（BA）或EVT0185。Semaglutide每两周一次皮下注射，可单独使用，也可与EVT0185联合使用（图3I）。EVT0185和BA均升高循环酮体（图S2D）。与预期一致，H&E切片未显示可检测的脂肪变性（图S2E）。与普通饲料对照小鼠相比，载体处理的CCl4小鼠PSR阳性面积增加（图3J、3K）。BA和semaglutide对PSR阳性面积没有影响，而EVT0185以及EVT0185联合semaglutide均降低PSR阳性面积（图3J、3K）。肝脏羟脯氨酸检测（图S2F）以及α-SMA染色切片分析（图3L、3M）也得到类似结果。这些数据表明，EVT0185可在不依赖脂肪变性变化的情况下减缓纤维化进展，提示其可能对HSC具有直接作用。
EVT0185降低肝胆固醇酯、HSC数量及其活化状态（图4，图S3，表S3–S6）
在多个不同MASH模型中证实EVT0185具有强效降低肝纤维化的有益作用后，研究者进一步探究介导这些作用的潜在机制。对EVT0185处理的TN-MASH小鼠肝脏进行生化分析发现，糖异生前体草酰乙酸以及脂肪酸氧化变构抑制剂丙二酰辅酶A均下降。这与血糖降低、酮体升高以及此前肝细胞特异性ACLY敲除小鼠中的观察结果一致。此外，研究者还观察到多种胆固醇酯（CEs）降低（表S3）。EVT0185对脂肪酸种类的影响更为复杂：部分脂肪酸下降，部分上升。具体而言，由SCD1介导棕榈酸和硬脂酸去饱和而生成的棕榈油酸（16:2）和亚油酸（18:2）均因EVT0185而升高。其他一些脂肪酸也呈现类似趋势，例如α-亚麻酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸，这些脂肪酸都是PPAR信号的强激活因子。
随后，研究者对载体或EVT0185处理的TN-MASH小鼠肝脏中约770个已注释的纤维化相关基因进行靶向分析。用于转录组分析的每组8只动物的MAS评分具有整个队列代表性。与载体对照相比，EVT0185上调86个基因、下调170个基因（表S5）。通路图显示，与脂质种类变化一致，EVT0185主要上调PPARγ和脂肪酸氧化通路（图S3A）。然而，在治疗暴露窗口内，EVT0185体外报告基因实验未显示其对PPAR活性有直接影响（表S6），提示这些效应很可能是脂质代谢物变化的继发结果。该分析中下调最明显的通路包括胆固醇代谢、肌成纤维细胞调控、胶原合成和细胞因子信号，提示EVT0185可能直接作用于HSC。
为更精细地评估EVT0185对HSC的潜在直接作用，研究者对载体或EVT0185处理的FAT-MASH小鼠肝脏进行了空间转录组学分析（图3A–3I）。利用Mmp7、Dcn、Igfbp7、Col3a1、Col1a1和Lum等HSC既定标志物，研究者在载体组和EVT0185组中识别出HSC群体（图4A–4C）。研究者还观察到一类肌成纤维细胞群体，该群体来源于驻留HSC的活化和增殖，并以Ltbp2、Mfap4、Lum、Cpxm2、Dcn、Col1a2、Col3a1、Dpt、Col1a1、Gpx3、Igfbp7和Gas6等ECM相关基因高表达为特征（图4A–4C）。这些细胞的位置与其预期作用一致：肌成纤维细胞位于血管周围，而HSC则弥散分布于整个肝脏（图4D）。与纤维化减少一致，EVT0185降低了HSC和肌成纤维细胞的比例（图4E），并降低HSC标志基因（Col1a1、Col1a2和Col3a1）以及肌成纤维细胞标志基因（Ltbp2、Mfap4、Lum、Col1a1、Col1a2和Col3a1）的表达（图4F）。HSC和成纤维细胞的差异表达基因分析显示，上调最明显的通路为脂肪酸代谢过程（图4G、4H）。进一步考察HSC和肌成纤维细胞中的脂肪酸分解代谢基因后发现，其基因表达特征与固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）及SREBP2靶基因升高一致（图S3B、S3C）。此外，肉碱酰基转移酶（Crat）和过氧化物酶体生物发生因子5（Pex5）也升高，这两条通路对维持乙酰辅酶A至关重要。许多肝细胞群体中也观察到类似变化（图S3B、S3C）。这些数据表明，EVT0185可诱导一种与HSC活化和增殖标志物下降相关的基因特征。
图4. 空间转录组学显示EVT0185降低FAT-MASH小鼠中HSC数量和活化状态
（A）聚类分析，显示载体或EVT0185处理肝脏中的细胞类型数量。
（B）UMAP harmony整合分析，突出显示HSC和成纤维细胞群体。
（C）标记HSC和成纤维细胞的基因特征。
（D）聚焦HSC和成纤维细胞的聚类分析，显示EVT0185处理小鼠中HSC和成纤维细胞减少。
（E）HSC和成纤维细胞百分比。
（F）比较载体处理与EVT0185处理后HSC和成纤维细胞的基因特征。
（G）火山图显示EVT0185处理小鼠与载体处理小鼠HSC中的失调基因。
（H）基因-概念网络图，显示基于EVT0185处理与载体处理小鼠HSC之间差异表达基因得到的相应基因本体（GO）术语。
EVT0185抑制HSC增殖通路并增强氧化代谢（图5）
为进一步强化空间转录组学数据所得结论，研究者还对FAT-MASH小鼠肝脏进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）（图3A–3I）。与空间转录组学分析一致，和载体处理小鼠相比，EVT0185处理小鼠中活化HSC（aHSC）的比例降低（图5A）。scRNA-seq数据的降维分析显示，在肝细胞和HSC中，载体组与EVT0185组之间存在清晰分离，说明EVT0185对这些细胞类型中的基因表达具有强烈影响（图5B）。
图5. FAT-MASH小鼠肝脏单细胞RNA测序分析显示，EVT0185增加HSC和肝细胞中的氧化代谢与脂肪酸代谢
（A）EVT0185组与载体组FAT-MASH小鼠中活化HSC比例（每组 n = 3）。p值采用β-二项广义线性模型计算，该模型以每个重复样本中HSC数量占总细胞数量的比例进行建模。
（B）肝细胞和HSC的降维分析（UMAP）（EVT0185组与载体组）。
（C）肝细胞中Slc27a2、Acly和Acss2的平均基因表达。BH校正p值采用Wilcoxon秩和检验计算。
（D）aHSC中Slc27a2、Acly和Acss2的平均基因表达。p值采用Wilcoxon秩和检验计算。
（E、F）EVT0185组相较载体组，在aHSC（E）和肝细胞（F）中显著富集的Hallmark基因集。
（G、H）aHSC（G）和肝细胞（H）中的SREBP1、SREBP2和PPARα靶基因。BH校正p值采用Wilcoxon秩和检验计算。
EVT0185可由SLC27A2转化为辅酶A硫酯（EVT0185-CoA），这是其竞争性抑制ACLY和ACSS2活性的必要条件。与预期一致，来自载体处理FAT-MASH小鼠的肝细胞表达Slc27A2、Acly和Acss2（图5C）。重要的是，aHSC中也观察到类似表达；有趣的是，EVT0185处理后这些基因表达还进一步升高（图5C、5D）。对aHSC进行基因集富集分析（GSEA）显示，EVT0185正向富集氧化磷酸化、脂肪酸代谢、过氧化物酶体和胆固醇稳态等Hallmark基因集；同时负向富集细胞增殖相关基因集（Wnt/β-catenin、纺锤体和G2-M检查点）、细胞周期与翻译相关基因集（E2F靶基因）以及上皮-间质转化基因集（图5E）。在肝细胞中，脂肪酸代谢和胆固醇稳态方面也观察到类似趋势，同时TNFα信号负向富集（图5F）。进一步分析这些基因集中的基因发现，在HSC（图5G）和肝细胞（图5H）中，许多经充分验证的SREBP1和SREBP2靶基因上调，同时Cyp4a14和Cyp4a10（PPARα靶基因）以及Crat和Pex5显著上调。这些数据表明，EVT0185可轻度增加SREBP靶基因；但与ACC抑制剂不同，EVT0185还可上调促进肝细胞和HSC氧化代谢的重要PPARα靶基因。
EVT0185抑制TGFβ1诱导的人源HSC活化（图6，图S4）
在证实EVT0185可在MASH小鼠模型中诱导与HSC抑制一致的转录特征后，研究者进一步测试这一作用是否可延伸至人类样本。首先，研究者使用来自接受肝细胞癌肿瘤切除手术患者的非恶性组织，制备精准切割肝切片，并检测EVT0185抑制DNL的效力。患者特征见表S7，肝脏病理显示6名受试者中有4人在手术时存在脂肪变性。在载体处理下，DNL速率差异很大；但EVT0185处理使每一对患者肝切片样本中的DNL均下降，平均降幅约33%（图6A）。使用相同方法的既往研究已验证该制备方式具有可行性，不过不同受试者之间的差异可能导致显著变异。
图6. EVT0185抑制DNL和TGFβ1诱导的原代人源HSC活化
（A）人肝切片经DMSO或EVT0185处理16小时后的从头脂肪生成（n = 6）。p值采用配对t检验。
（B）UMAP图显示健康对照或MASLD个体肝脏中的HSC群体（每组 n = 2）。p值来自双比例z检验。
（C）人HSC中SLC27A2的平均基因表达。BH校正p值采用Wilcoxon秩和检验计算（每组 n = 2）。
（D）代表性流式细胞术图像，显示在载体、TGFβ1或TGFβ1 + EVT0185处理后，原代人HSC中α-SMA抗体阳性细胞亚群。
（E、F）（E）α-SMA高表达/α-SMA低表达细胞群百分比，以及（F）载体、TGFβ1或TGFβ1 + EVT0185处理后的前胶原1A1生成（n = 3）。
（G、H）相对于载体对照，EVT0185处理的原代人HSC中放射性标记乙酸掺入固醇（G）或脂肪酸（H）的情况（每组 n = 3）。
数据以均值±SEM表示。显著性检验采用单因素ANOVA后接Dunnett事后检验或非配对t检验。n.s.表示不显著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
为评估EVT0185在人源HSC中转化为活性辅酶A硫酯的可能性，研究者分析了公开可用的单核RNA测序数据，比对健康对照和MASLD患者肝脏中的SLC27A2表达。该分析发现，MASLD患者肝脏中HSC比例更高（图6B），且更重要的是，与健康对照相比，MASLD患者HSC中的SLC27A2表达更高（图6C）。随后，研究者在TGFβ1处理的原代人HSC中评估EVT0185作用。与载体对照相比，TGFβ1处理增加了α-SMA高表达细胞群相对于α-SMA低表达细胞群的比例（图6D、6E）。重要的是，EVT0185在很大程度上阻断了这种TGFβ1诱导的活化（图6D、6E）。此外，与TGFβ1单独处理相比，EVT0185处理的TGFβ1活化HSC中前胶原1A1生成减少（图6F）。与全肝中胆固醇酯下降的观察一致（表S3），EVT0185降低了由乙酸生成固醇的合成（图6G），但不降低由乙酸生成脂肪酸的合成（图6H）。由于巨噬细胞缺乏SLC27A2，EVT0185未能抑制培养的骨髓来源巨噬细胞（BMDM）中的炎症标志物（图S4A、S4B）。这些数据表明，EVT0185可抑制原代人肝切片和HSC中的DNL，并减少TGFβ1诱导的原代人HSC活化。
EVT0185通过依赖SLC27A2、ACLY和ACSS2的通路抑制HSC活化（图7，图S5）
为进一步研究EVT0185抑制HSC活化的机制，研究者需要使用一种易于进行基因编辑的系统。LX2细胞来源于人HSC，经SV40转化，在TGFβ1处理后具有许多活化人HSC的转录特征。然而，与来自小鼠和人类的HSC不同，LX2细胞不表达SLC27A2（图S5A），这一点与其他永生化细胞系一致。
为克服这一限制并评估EVT0185在LX2细胞中的作用，研究者构建了两种细胞系：一种稳定表达空对照载体（PRP-empty），另一种表达人SLC27A2（PRP-SLC27A2）（图7A）。利用这些细胞系，研究者在培养基中同时存在葡萄糖和乙酸（500 μM）的条件下，测试BA或EVT0185对TGFβ1诱导活化的影响。不同于此前在含葡萄糖但不含乙酸培养基中培养的原代HSC研究，无论是PRP-empty细胞还是PRP-SLC27A2细胞，BA处理均未抑制TGFβ1诱导的培养基中前胶原1A1分泌（图S5B、S5C）。相反，EVT0185降低了PRP-SLC27A2细胞培养基中的前胶原1A1水平（图7B），但对PRP-empty细胞无此作用（图S5D）。在相同条件下进行的PrestoBlue细胞活力检测显示，细胞活力并未下降，说明EVT0185对前胶原1A1的影响源于活化减少，而非细胞死亡（图S5E、S5F）。这些数据表明，EVT0185可在葡萄糖和乙酸同时存在时降低TGFβ1诱导的HSC活化，且这一作用依赖SLC27A2。
图7. EVT0185通过依赖SLC27A2、ACLY和ACSS2的通路抑制HSC活化
（A）转染对照质粒（PRP-empty）或表达SLC27A2质粒（PRP-SLC27A2）的LX2细胞中SLC27A2蛋白表达。
（B）在PRP-SLC27A2细胞中，与TGFβ1或TGFβ1 + 不同浓度EVT0185共同处理24小时后，相对于DMSO的人前胶原1A1水平（每组 n = 3）。
（C）WT、shACLY、shACSS2或shACLY + shACSS2敲低细胞在无TGFβ1（载体）或TGFβ1处理24小时后的人前胶原1A1水平（每组 n = 3）。
（D）表达WT或ACLY + ACSS2敲低的PRP-SLC27A2细胞，经载体、TGFβ1或TGFβ1 + EVT0185处理24小时后测得的人前胶原1A1水平（每组 n = 6）。
（E）PRP-SLC27A2 WT或ACLY + ACSS2敲低细胞经DMSO或EVT0185处理24小时后，放射性标记乙酸掺入固醇或脂肪酸的情况（每组 n = 3）。
（F）韦恩图比较EVT0185相对于载体在PRP-empty或PRP-SLC27A2细胞中对差异富集Hallmark基因集的影响。
（G）PRP-SLC27A2表达细胞中差异富集Hallmark基因集的散点图。
（H、I）PRP-SLC27A2表达细胞经载体、TGFβ1或TGFβ1 + EVT0185处理，并在培养基中加入乙酸或甲羟戊酸内酯后，培养基中的人前胶原1A1水平（H）和细胞增殖率（I）（每组 n = 3）。
数据以均值±SEM表示。显著性检验采用单因素ANOVA后接Dunnett事后检验，以及双因素ANOVA后接Tukey或Fisher最小显著差异事后检验。n.s.表示不显著；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。
与BA相比，EVT0185在乙酸和葡萄糖同时存在时效力更强，这使研究者提出假设：同时抑制ACLY和ACSS2可能对降低TGFβ1诱导的HSC活化很重要。为直接检验这一假设，研究者构建了可诱导短发夹RNA敲低ACLY（shACLY）、ACSS2（shACSS2）或二者同时敲低（shACLY + shACSS2）的LX2细胞（图S5G），并在有或无TGFβ1条件下检测胶原生成（图7C）。与BA实验观察一致，无论培养基中是否存在乙酸，shACLY对胶原生成的影响都很有限（图7C左侧两图）。相反，shACSS2以及shACLY + shACSS2均显著降低基础状态和TGFβ1刺激下的胶原生成（图7C右侧两图）；这一差异不能由细胞活力变化解释，因为三种基因型中的细胞活力下降程度相近（图S5H）。随后，研究者评估EVT0185在异位表达SLC27A2并伴有shACLY + shACSS2的LX2细胞中抑制胶原生成和DNL的作用。结果显示，虽然shACLY + shACSS2可降低胶原生成（图7D）并抑制固醇和脂肪酸合成（图7E），但EVT0185并未产生额外作用。这些数据表明，遗传性抑制ACLY + ACSS2，或使用EVT0185进行药理学抑制，均可阻断LX2细胞中TGFβ1刺激的胶原生成和DNL。
为评估EVT0185抑制HSC活化的潜在机制，研究者对经TGFβ1刺激并与EVT0185共同处理24小时的LX2细胞（有或无SLC27A2）进行了RNA测序。与SLC27A2重要性的观察一致，相较PRP-empty细胞，EVT0185处理PRP-SLC27A2细胞系后差异表达基因数量增加超过7倍（图7F）。与体内空间转录组学和scRNA-seq结果类似，在EVT0185处理的PRP-SLC27A2细胞中，相较未处理细胞，脂肪酸代谢和氧化磷酸化Hallmark基因集最为富集。此外，研究者还检测到Hedgehog信号以及G2-M检查点/有丝分裂基因集受到抑制；这些基因集分别对HSC活化和增殖至关重要（图7G）。值得注意的是，EVT0185处理LX2细胞后，胆固醇稳态和胆固醇合成基因集显著升高，这与FAT-MASH模型中HSC的结果一致（图4、图5）。由于SREBP2靶基因和胆固醇合成/清除基因集大幅升高，而胆固醇对HSC增殖和活化又十分关键，因此研究者推测，补充胆固醇前体如甲羟戊酸内酯（100 μM），可能会阻断EVT0185抑制TGFβ1诱导HSC活化的作用（图S5I）。与这一假设一致，加入甲羟戊酸内酯后，EVT0185在PRP-SLC27A2细胞中降低24小时胶原合成（图7H）和7天细胞增殖（图7I）的作用被阻断；但在PRP-empty细胞中没有影响（图S5J、S5K）。这些数据强烈提示，抑制胆固醇合成有助于EVT0185对HSC胶原生成和增殖的抑制作用。
【Citation】:Di Pastena F, Gautam J, Lally JSV, et al. Dual inhibition of ACLY and ACSS2 by EVT0185 reduces steatosis, hepatic stellate cell activation, and fibrosis in mouse models of MASH.Cell Metab.2026;38(1):33-49.e10.
【贡献】★★★★★
本研究表明，EVT0185通过降低DNL并促进脂肪酸氧化来减轻脂肪变性。同时，研究识别出乙酸代谢是HSC活化的重要驱动因素，并显示ACSS2对胆固醇合成和胶原生成至关重要。因此，ACSS2构成了抑制肝纤维化的一个核心脆弱环节，也使EVT0185区别于那些不作用于该轴线的其他DNL抑制剂。未来研究应在诱导型HSC特异性模型和人肝来源类器官中，结合同位素示踪和空间代谢组学，进一步考察EVT0185和ACSS2的作用，以直接阐明这些通路在推动MASH和肝纤维化中的重要性。
研究局限性：虽然EVT0185已在多个互补性小鼠模型中得到检验，这些模型能够复现人类MASH的关键组织学和转录组特征，但它们并不能完全反映人类疾病的慢性和异质性。虽然转录组数据和原代人HSC实验支持EVT0185对星状细胞活化具有直接作用，但仍需要在体内使用星状细胞特异性删除ACLY和ACSS2的方法来确认因果关系。最后，尽管研究结果强调乙酸代谢是星状细胞活化和纤维发生的关键驱动因素，但本文并未在体内直接量化乙酸通量及其对乙酰辅酶A和胆固醇合成的贡献。未来使用同位素示踪和细胞特异性模型的研究，将有助于更细致地阐明这些机制。
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