自噬（macroautophagy/autophagy）是真核细胞中高度保守的细胞内降解途径，通过溶酶体清除受损细胞器或有害物质，在营养应激、免疫应答、细胞器修复乃至程序性细胞死亡中发挥关键作用【1】。自噬失调与肿瘤、神经退行性疾病、感染和代谢综合征等多种重大疾病密切相关，因此被视为重要的治疗靶点【2,3】。然而，自噬是一个高度动态、多步骤的过程，如何精准测量活体系统内的自噬流一直是领域内的重要技术瓶颈【4】。当前应用最广的mRFP-GFP-LC3系统虽能区分自噬体与自噬溶酶体，却严重依赖基因转染，在原代细胞中效率低下，且背景信号高、难以推广至活体动物，使得非基因编码的新型探针成为迫切需求。现有小分子荧光探针虽无需转染，但多基于pH、极性等微环境特征，特异性不足；而靶向LC3的探针则面临细胞通透性差、无法在自由态、自噬体结合态与自噬溶酶体结合态间给出差异化信号等挑战，难以准确追踪自噬流全貌【5】。
近日，浙江大学药学院李新教授团队携手南京医科大学药学院韩峰教授、基础医学院卢应梅教授团队针对上述难题在Autophagy期刊发表了题为Iterative design leads to a smart probe capable of quantifying autophagic flux with switchable fluorescence via engaging MAP1LC3/LC3的研究，开发了一种名为ATP1的活性小分子荧光探针。该探针具有分子量小、细胞膜通透性好、信号智能动态的特点，通过与自噬标志蛋白LC3直接结合实现高度特异性，并利用微环境敏感的光谱特性，实现对活细胞自噬流的实时动态监测。
ATP1的设计理念源于自噬受体识别LC3的核心机制。自噬受体通过其LIR基序（通常包含ΦXXΨ序列）与LC3结合，为探针开发提供了天然的靶向模板【6】。然而，传统LIR肽段往往面临亲和力与细胞通透性难以兼得的困境。基于这一机制，研究团队提出一项巧妙策略：将LIR序列最小化以保障膜通透性，同时筛选能参与蛋白亲和的荧光团以补足序列最小化对亲和作用的不利影响，最后通过对该荧光团的结构-光物理性质改造赋予其微环境敏感的智能信号，使探针呈现出结合至自噬小体富集的LC3致荧光开启，自噬小体与溶酶体融合致荧光变色的性质，最终实现不同阶段自噬流的动态监测。
经过在基础自噬、药物诱导自噬及基因敲除等多重验证体系下，证明ATP1能特异性成像自噬流。与传统mRFP-GFP-LC3系统相比，ATP1不仅操作简便、成像均一、信噪比高，更突破了原代细胞外源基因导入困难的瓶颈，成功实现了原代神经元中自噬流的实时动态检测。在体外氧糖剥夺模型和野生型小鼠缺血性脑卒中模型中，成功实时可视化了自噬体形成及其与溶酶体融合的动态过程，为理解缺血损伤下的自噬调控作用提供了新见解。此外，得益于其巧妙的设计，ATP1能够灵敏捕捉自噬流的细微变化，在自噬调节剂的高通量筛选中展现出突出优势。总之，“自噬不再是静态的快照，而是一部可以实时回放的电影。”ATP1为自噬成像提供了全新工具视角，有望拓展至更多自噬相关疾病的机制研究与药物筛选等应用场景。
浙江大学药学院李新教授、南京医科大学药学院韩峰教授和南京医科大学基础医学院卢应梅教授为共同通讯作者。南京医科大学基础医学院卢亚萍博士与浙江大学药学院硕士生王宁为论文的共同第一作者。
原文链接：https://doi.org/10.1080/15548627.2026.2674717
制版人：十一
参考文献
[1] Mizushima N. A brief history of autophagy from cell biology to physiology and disease.Nat Cell Biol2018; 20:521-7.
[2]Mizushima N, Levine B. Autophagy in Human Diseases.N Engl J Med2020; 383:1564-76.
[3]Zhao YG, Codogno P, Zhang H. Machinery, regulation and pathophysiological implications of autophagosome maturation.Nat Rev Mol Cell Biol2021; 22:733-50.
[4] Klionsky DJ, Abdel-Aziz AK, Abdelfatah S, Abdellatif M, Abdoli A, Abel S, et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition).Autophagy2021; 17:1-382.
[5] Li X, Liang X, Yin J, Lin W. Organic fluorescent probes for monitoring autophagy in living cells.Chem Soc Rev2021; 50:102-19.
[6] Vargas JNS, Hamasaki M, Kawabata T, Youle RJ, Yoshimori T. The mechanisms and roles of selective autophagy in mammals.Nat Rev Mol Cell Biol2023; 24:167-85.
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