2026年5月19日，南方医科大学刘叔文团队、清华大学饶燏团队、中国中医科学院王继刚团队等，在British Journal of Pharmacology（Journal Impact Factor=7.5）在线发表题为“Caspase Recruitment Domain 6 (CARD6) is the therapeutic target of dihydroartemisinin for lupus nephritis based on Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC) technology”的研究论文。该文于2025年5月22日投稿，2026年3月31日修回，2026年4月22日接收。
该研究围绕二氢青蒿素（DHA）治疗狼疮性肾炎（LN）的药理靶点不清这一关键问题，利用蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术设计了DHA衍生工具分子A1，并结合定量蛋白质组学、DARTS、CETSA、Co-IP、免疫荧光、分子对接及体内AAV9介导的CARD6沉默实验，确认半胱天冬酶募集结构域蛋白6（CARD6）是DHA发挥抗炎和肾脏保护作用的重要靶点。研究提示，DHA可作用于CORE-CARD6的481–949 aa区域，抑制CARD6/RIP2/NF-κB信号通路，从而减轻M1型巨噬细胞相关炎症反应和MRL/lpr小鼠肾脏损伤。
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【摘要】
背景与目的：狼疮性肾炎（LN）是系统性红斑狼疮（SLE）的常见并发症，也是导致患者发病和死亡的重要因素。二氢青蒿素（DHA；artenimol）在LN中显示出良好的治疗效果，但其药理作用靶点仍不清楚。本研究利用蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术，识别DHA治疗LN的潜在靶点。
实验方法：研究首先在体外通过细胞毒性实验和抗炎实验评估新型化合物A1的活性。随后，利用A1结合蛋白质组学筛选DHA靶点，并通过Western blot、共免疫沉淀（Co-IP）、免疫荧光、分子对接、细胞热转变实验（CETSA）和药物亲和反应靶点稳定性实验（DARTS）进行体外验证。在体内实验中，研究检测了24小时尿蛋白、炎症因子、血清生化指标、免疫复合物沉积和肾脏病理损伤。同时，通过腺相关病毒介导的RNA干扰沉默CARD6，在MRL/lpr小鼠中系统评估DHA的作用及其靶点依赖性。
主要结果：CARD6是受A1影响最显著的降解蛋白，并被鉴定为DHA的作用靶点。具体而言，DHA与CORE-CARD6的481–949 aa区域相互作用。DHA通过阻断CARD6，抑制RIP2/NF-κB通路，并在体内和体外表现出抗炎作用。沉默CARD6能够改善MRL/lpr小鼠的炎症反应。值得注意的是，当CARD6被敲低后，DHA对MRL/lpr小鼠的抑制作用被削弱或消失。
结论与意义：CARD6是DHA用于LN干预的重要治疗靶点。该发现强调了PROTAC技术在高效识别天然产物治疗靶点方面的应用潜力。
01
研究背景及科学问题
系统性红斑狼疮（SLE）是一类自身免疫性疾病，其特点是免疫系统攻击多个器官。多达70%的儿童SLE患者以及约30%–60%的成人SLE患者会发生狼疮性肾炎（LN）。LN不仅是SLE最严重的器官受累表现之一，也是SLE患者死亡的重要原因；约20%的患者可能在5年内进展为终末期肾病。LN的发生与先天免疫和适应性免疫之间的相互作用有关，涉及自身抗体产生、免疫复合物沉积以及机体对自身抗原免疫耐受的丧失。临床上，LN常表现为蛋白尿和肌酐升高，病情可从轻度肾病性蛋白尿发展至弥漫性肾小球肾炎，进一步引发慢性肾损伤，最终导致终末期肾衰竭。目前，LN的明确药理靶点仍未完全阐明，现有临床干预措施也难以在避免明显不良反应的同时有效延缓疾病进展。因此，阐明LN的发病机制并探索新的治疗策略十分必要。
巨噬细胞是先天免疫系统的重要组成部分，也是连接先天免疫和适应性免疫反应的桥梁。根据受到的刺激类型不同，巨噬细胞可分化为两种主要表型：经典激活的M1型巨噬细胞具有促炎作用，参与清除病原体和抗感染过程；激活的M2型巨噬细胞则具有抗炎功能，参与伤口愈合和组织修复。巨噬细胞极化状态异常是LN恶化的重要因素。过度活化的M1型巨噬细胞可促进自身抗原暴露和免疫复合物沉积，激活系膜细胞分泌炎症因子，并诱导细胞增殖。肾脏单核细胞和巨噬细胞持续浸润，是MRL/lpr小鼠严重组织损伤的重要原因。此外，巨噬细胞浸润程度与LN患者蛋白尿水平和不良肾脏结局密切相关。因此，巨噬细胞可能是控制LN的重要治疗靶点。
二氢青蒿素（DHA；artenimol）是青蒿素的一代衍生物，被认为是一种高效、低毒、起效快的抗疟药。与青蒿素相比，DHA的抗疟活性更强，复发率较低。值得注意的是，在抗疟治疗取得成功之后，屠呦呦团队还发现DHA具有较强的抗炎和免疫调节特性，并在LN中显示出良好的治疗效果。然而，DHA发挥作用的药理靶点仍不明确。因此，阐明DHA治疗LN的作用机制，有助于为后续研究提供新的方向。
蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）是一类用于选择性降解靶蛋白的新型工程化技术。PROTAC通常由两个配体和一个连接子组成：其中一个配体招募目标蛋白，另一个配体结合E3泛素连接酶，从而诱导目标蛋白泛素化。PROTAC通过“劫持”E3泛素连接酶活性，使目标蛋白发生泛素化，并经泛素-蛋白酶体系统降解。不同于传统抑制剂依赖持续高浓度占据靶点的作用方式，PROTAC通过事件驱动机制发挥作用，只需催化量化合物和较弱的靶点相互作用，即可诱导蛋白降解。这一特性使其有望处理传统意义上“不可成药”的蛋白。此外，解离后的PROTAC还可被循环利用，参与多轮降解过程，在克服耐药和降低脱靶效应方面具有潜在优势。由于DHA等天然产物常通过中等亲和力或瞬时相互作用影响蛋白，而这些蛋白可能缺乏明确结合口袋，传统基于亲和力的靶点识别方法往往存在局限。相比之下，基于PROTAC的筛选依赖诱导降解而非直接结合亲和力，因此更适合开展无偏靶点识别。基于这一思路，作者将DHA与CRBN E3连接酶配体偶联，设计了PROTAC工具化合物A1，并将其作为筛选探针，用于识别DHA在LN中的潜在靶点。
半胱天冬酶募集结构域蛋白6（CARD6）是一种与微管相互作用的蛋白，属于CARD蛋白家族。CARD6曾被认为与结直肠癌、胃癌和食管癌等肿瘤的发生有关。CARD6可受干扰素刺激，并参与适应性或先天免疫反应。既往研究显示，CARD6可与受体相互作用蛋白2（RIP2，也称RICK）形成复合物，进而激活NF-κB并增强炎症反应。不过，也有研究提示CARD6可能通过抑制NF-κB活化减轻肝脏缺血/再灌注损伤，CARD6表达增加还可在压力负荷条件下保护心肌免于肥大。因此，CARD6在LN中的确切作用仍有待阐明。
在本研究中，作者利用DHA的新型PROTAC衍生策略，并结合定量蛋白质组学分析，识别DHA治疗LN的作用靶点。研究证实，DHA可与CORE-CARD6的481–949 aa区域相互作用。从机制上看，DHA通过抑制CARD6/RIP2/NF-κB通路，在体内外减轻炎症反应。腺相关病毒（AAV）介导的RNA干扰沉默CARD6可减轻MRL/lpr小鼠肾功能障碍。值得注意的是，在CARD6被敲低后，DHA对MRL/lpr小鼠的抗炎作用消失。总体而言，研究结果提示CARD6是DHA治疗LN的重要靶点，也显示出PROTAC技术用于识别天然化合物治疗靶点的巨大潜力。
02
重要发现及亮点
PROTAC技术设计的化合物A1具有抗炎和免疫调节作用
为探索二氢青蒿素（DHA）治疗狼疮性肾炎（LN）的潜在机制，作者以DHA为基础构建了一个小型PROTAC分子库。在E3连接酶配体选择方面，研究采用了具有较广泛降解效率的泊马度胺。考虑到连接子对PROTAC分子降解活性具有重要影响，作者引入不同长度的烷基链和酰胺键连接子，最终获得A1–A8等化合物。
随后，研究通过MTT实验评估这8种PROTAC衍生物的细胞毒性。除A2表现出较强细胞毒性外，其余7种化合物对THP-1来源巨噬细胞的细胞活力几乎没有影响，且差异无统计学意义。因此，作者进一步在脂多糖（LPS）和干扰素γ（IFN-γ）诱导的M1型巨噬细胞模型中评估这7种化合物的抗炎活性。结果显示，与其他化合物相比，A1对IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA表达的抑制作用最强。同时，A1以浓度依赖性方式下调M1表型标志蛋白CD86、TNF-α和IL-1β的表达，并降低THP-1来源巨噬细胞上清液中IL-6和IFN-β的水平。这些结果表明，A1具有较好的抗炎和免疫调节作用，可抑制THP-1来源巨噬细胞向M1表型极化。因此，A1被用于后续研究。
图1：基于PROTAC技术设计的化合物A1表现出良好的抗炎和免疫调节作用，可抑制THP-1来源巨噬细胞向M1表型极化。（a）采用RT-qPCR检测由LPS（1 μg·ml−1）和IFN-γ（20 ng·ml−1）诱导的THP-1来源M1巨噬细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达，并使用DHA和7种PROTAC化合物进行处理。（b）M1活化巨噬细胞中CD86、TNF-α和IL-1β的蛋白表达及相对定量。（c,d）提取THP-1巨噬细胞上清液，并通过ELISA检测IL-6和IFN-β水平。（e,f）DHA和化合物A1的结构。每组n=5。<0.05表示与对照组相比差异显著；*P<0.05表示与LPS和IFN-γ组相比差异显著。
A1诱导CARD6降解，提示CARD6可能是DHA抗炎作用的靶点
为明确DHA在LN中的潜在靶点，作者以化合物A1作为筛选工具，对M1炎症性巨噬细胞进行了蛋白质组学分析。与对照组相比，M1组共有249个蛋白上调、192个蛋白下调。A1处理后，研究发现9个重叠的差异下调蛋白，其中CARD6是降解最明显的蛋白。
Western blot进一步验证显示，A1可浓度依赖性地诱导CARD6蛋白降解。DHA处理也可快速且持续降低CARD6蛋白丰度：定量分析显示，CARD6水平在处理后1小时内显著下降，并在2–8小时内维持较低平台，且在24小时内始终显著低于基线；与DMSO对照相比，DHA处理后1–24小时各时间点的CARD6水平均显著降低（P<0.01）。不过，当联合使用蛋白酶体抑制剂MG132、carfilzomib或NEDD8激活酶E1亚基抑制剂pevonedistat（MLN4924）时，CARD6降解被挽救，提示A1诱导的CARD6降解依赖泛素-蛋白酶体系统。
进一步的共免疫沉淀实验显示，在HEK293T细胞中转染His标签CRBN和HA标签CARD6后，只有A1处理组中CRBN能够直接结合CARD6。同时，DHA和CRBN E3连接酶配体泊马度胺均可与A1竞争，从而削弱A1对CARD6的降解作用。这提示，A1介导CARD6降解需要同时结合DHA相关靶点和CRBN E3连接酶，并形成三元复合物。DARTS实验也显示，A1处理后CARD6对蛋白酶降解的稳定性发生改变。总体而言，这些结果表明，A1诱导CARD6降解是由泛素-蛋白酶体系统介导的，并提示CARD6可能是DHA在LN中发挥抗炎作用的特异性靶点。
图2：CARD6可被化合物A1降解，提示其可能是二氢青蒿素（DHA）抗炎作用的靶点。（a）与炎症相关的上调和下调蛋白分别以红色和蓝色显示，并以倍数变化（M1/Control）与−log10 P值绘制。（b）与LPS（1 μg·ml−1）和IFN-γ（20 ng·ml−1）诱导的THP-1来源M1巨噬细胞相比，对不同浓度A1处理后差异下调蛋白进行重叠分析。（c）不同浓度A1处理下9个重叠下调蛋白的丰度（标准化显示）。（d,e）CARD6蛋白的浓度依赖性降解。（f,g）CARD6蛋白在不同时间点的降解效率。（h,i）使用MG132（5 μM）、MLN4924（1 μM）或carfilzomib（0.4 μM）干预4小时后检测CARD6蛋白水平。（j）在HEK293T细胞中使用A1或DHA（10 μM）干预后，检测CRBN与CARD6的免疫沉淀。（k,l）THP-1来源巨噬细胞中，A1（10 μM）与DHA或泊马度胺（10 μM）共同处理4小时后CARD6蛋白水平的变化。（m,n）采用DARTS实验检测CARD6蛋白稳定性。每组n=5。<0.05表示与DMSO组相比差异显著；*P<0.05表示与Pronase蛋白酶组相比差异显著。
DHA通过破坏CARD6与RIP2结合，阻断NF-κB活化
由于CARD6能够与RIP2形成复合物，从而促进NF-κB活化并增强炎症反应，作者首先考察A1诱导CARD6降解是否会影响RIP2和NF-κB活化。结果显示，当CARD6在1小时开始降解时，RIP2和磷酸化p65（p-p65）蛋白水平也随之下降。A1处理可降低RIP2和p-p65表达，而联合蛋白酶体抑制剂MG132、carfilzomib或NAE抑制剂MLN4924后，这一作用被逆转。当A1与DHA或CRBN E3连接酶配体泊马度胺共同孵育时，A1对RIP2和NF-κB磷酸化的抑制作用也被削弱。由此说明，CARD6降解确实可触发RIP2下调和NF-κB活化受抑。
为进一步验证NF-κB活化是否由CARD6与RIP2相互作用介导，作者在HEK293T细胞中转染HA标签CARD6和FLAG标签RIP2，并通过共免疫沉淀进行检测。结果显示，CARD6可直接结合RIP2，并显著促进p65磷酸化，而DHA或A1处理后这一过程明显受到抑制，同时CARD6泛素化增强。免疫荧光结果显示，CARD6与RIP2的相互作用主要发生在细胞质中；DHA或A1处理后，这种共定位明显减弱。此外，CARD6与RIP2相互作用可诱导NF-κB p65核转位，而DHA或A1处理同样能够阻断这一核转位过程。总体来看，这些结果表明，DHA可通过破坏CARD6与RIP2相互作用抑制NF-κB活化，也进一步支持CARD6是通过PROTAC技术识别出的DHA潜在靶点。
图3：二氢青蒿素（DHA）通过破坏CARD6与RIP2结合来阻断NF-κB活化。（a）RIP2、p65和p-p65蛋白表达及相对定量的时间进程分析。（b）使用MG132（5 μM）、MLN4924（1 μM）或carfilzomib（0.4 μM）干预后，检测RIP2、p65和p-p65蛋白水平及相对定量。（c）THP-1来源巨噬细胞中，A1（10 μM）与DHA或泊马度胺（10 μM）共同处理后，检测RIP2、p65和p-p65蛋白表达及相对定量。（d,e）HEK293T细胞中CARD6和RIP2的免疫沉淀实验。（f）采用免疫荧光和共聚焦成像分析CARD6（红色）与RIP2（绿色）的共定位图像，放大倍数为60×。（g）HEK293T细胞中NF-κB（红色）荧光信号，放大倍数为63×。细胞核用DAPI染为蓝色。比例尺为20 μm。每组n=5。<0.05表示与DMSO组相比差异显著；*P<0.05表示与Pronase蛋白酶组相比差异显著。
DHA减轻人肾小球系膜细胞炎症反应和异常增殖
巨噬细胞浸润可促进自身抗原暴露和免疫复合物沉积，进而激活系膜细胞分泌炎症因子并诱导异常增殖。为解析巨噬细胞与系膜细胞之间的相互作用，作者建立了0.4 μm Transwell共培养系统，避免两类细胞直接接触，并收集人肾小球系膜细胞（HMC）进行分析。
结果显示，在模型组HMC上清液中，IL-6和IL-1β水平显著升高；DHA或A1处理后，这些炎症因子以浓度依赖性方式明显下降。进一步研究显示，LPS和IFN-γ可促进HMC中CARD6、RIP2、p-p65、TNF-α和IL-1β蛋白表达，而DHA或A1干预后，这些蛋白水平均以浓度依赖性方式受到抑制。免疫荧光观察显示，DHA或A1处理后，CARD6与RIP2的相互作用减弱，由此引发的NF-κB活化也受到抑制。这些结果提示，DHA可通过CARD6/RIP2/NF-κB信号通路抑制巨噬细胞向M1表型极化，并减轻HMC异常增殖所引发的炎症反应。
图4：二氢青蒿素（DHA）通过抑制CARD6/RIP2/NF-κB信号通路减轻人肾小球系膜细胞（HMC）增殖。（a,b）与分化后的THP-1巨噬细胞共培养后，提取人肾小球系膜细胞（HMC）上清液，并通过ELISA检测IL-1β和IL-6水平。（c,d）检测HMC中CARD6、RIP2、p65、p-p65、pro-IL-1β、IL-1β和TNF-α的蛋白表达及相对定量。（e）采用免疫荧光和共聚焦成像分析HMC中CARD6（红色）与RIP2（绿色）的共定位图像，放大倍数为60×。（f）通过共聚焦检测HMC细胞中NF-κB（红色）荧光信号。细胞核用DAPI染为蓝色。比例尺为20 μm。放大倍数为63×。每组n=5。<0.05表示与对照组相比差异显著；*P<0.05表示与LPS和IFN-γ组相比差异显著。
CARD6是DHA抗炎作用的潜在靶点
为进一步验证CARD6是否是DHA的作用靶点，作者在分化后的THP-1巨噬细胞中使用小干扰RNA（siRNA）敲低CARD6。RT-qPCR和Western blot结果显示，siCARD6-1沉默效率最高，因此被用于后续实验。CARD6敲低后，M1巨噬细胞中IL-6、TNF-α、IL-1β和IFN-β mRNA表达下降。与siCARD6组相比，在CARD6沉默后再给予DHA或A1处理，并未出现进一步显著差异。
在蛋白水平上，CARD6缺失显著降低RIP2、p-p65和TNF-α表达，而DHA或A1处理没有进一步改变这些效应。此外，CARD6敲低后，CARD6与RIP2的共定位被破坏，NF-κB p65核转录受到抑制；类似地，在敲低CARD6后，DHA和A1针对CARD6的作用也被消除。
分子对接分析显示，DHA可结合于CARD6内部腔体，结合自由能较低，并可与Gly813残基形成氢键，与Lys848残基形成盐桥相互作用。CARD6由1037个氨基酸组成，结构上包括N端CARD结构域、CARD之后的谷氨酸富集区域（GARR），以及C端脯氨酸富集区域（PRR）。为进一步定位药物作用于CARD6蛋白的具体序列，作者构建了6种截短突变体，分别删除CARD、PRR或CARD、PRR、GARR的组合区域。结果显示，DHA和A1主要作用于CORE-CARD6的481–949 aa序列。CETSA和DARTS实验进一步证实，DHA与CARD6的481–949 aa区域相互作用，表现为CORE-CARD6（481–949 aa）蛋白的细胞热稳定性增强以及蛋白酶降解减少。综合这些结果，DHA通过靶向CARD6阻断RIP2/NF-κB通路，从而抑制M1巨噬细胞极化。
图5：CARD6是二氢青蒿素（DHA）发挥抗炎作用的潜在靶点。（a）在有无siCARD6干扰的M0和M1巨噬细胞中，检测CARD6、RIP2、p65、p-p65和TNF-α的蛋白水平及相对定量。每组n=5。<0.05表示与M0组中的siControl相比差异显著；*P<0.05表示与M1组中的siCARD6组相比差异显著；ns表示无显著性差异。（b）敲低CARD6对M1表型巨噬细胞中CARD6与RIP2共定位的影响。（c）敲低CARD6对M1表型巨噬细胞中NF-κB p65的影响。（d）DHA与CARD6的推测结合模式。（e）CARD6突变体组成。数字标示人CARD6蛋白中所示残基的位置。所有蛋白均以C端含HA标签的融合蛋白形式呈现。（f,g）通过过表达6种截短突变体，在THP-1巨噬细胞中采用Western blot分析CARD6。（h–j）采用CETSA和DARTS实验确认DHA与CORE-CARD6 481–949 aa序列的结合。每组n=5。<0.05表示与DMSO组相比差异显著；*P<0.05表示与Pronase蛋白酶组相比差异显著。
DHA在MRL/lpr小鼠中减轻肾功能异常和肾脏炎症
体外实验已经显示，DHA可通过靶向CARD6并抑制RIP2/NF-κB通路，减少促炎因子产生。基于此，作者进一步在MRL/lpr小鼠中验证体内作用。结果显示，与对照组相比，MRL/lpr小鼠从第10周开始24小时尿蛋白升高，而DHA能够降低尿蛋白水平。血清抗双链DNA（anti-dsDNA）IgG抗体是与LN疾病活动相关的生物标志物，也可预测疾病进展。研究发现，MRL/lpr组anti-dsDNA IgG抗体水平显著升高，而DHA干预后该水平有效降低。与此同时，血清肌酐和血尿素氮也在DHA处理后下降，提示DHA具有一定肾脏保护作用。
由于LN肾功能下降与炎症密切相关，作者通过ELISA检测MRL/lpr小鼠血清炎症水平。结果显示，未处理MRL/lpr小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著高于对照组，而DHA干预后这些炎症因子下降。肾脏组织学进一步显示，MRL/lpr小鼠肾组织存在形态异常、结构损伤和系膜细胞增殖；PAS染色显示肾小管排列松散和基质扩张；Masson染色显示肾小球萎缩和间质纤维化。DHA处理后，上述病理改变得到缓解。此外，模型组肾小球内IgG和C3补体荧光信号增强，而DHA处理后信号明显减少，提示免疫复合物沉积减轻。
持续性M1巨噬细胞浸润是肾脏炎症的重要原因，可导致MRL/lpr小鼠严重肾损伤。结果显示，MRL/lpr小鼠肾组织中iNOS、IL-1β、IFN-α、IL-6、IFN-β和TNF-α基因表达上调；DHA注射主要抑制iNOS和TNF-α生成。蛋白水平上，MRL/lpr小鼠肾组织中iNOS、CD86、TNF-α和IL-1β表达升高，而DHA治疗后这些表达显著受抑。模型小鼠肾脏中F4/80和CD86阳性巨噬细胞荧光信号明显增强，DHA干预后巨噬细胞聚集显著减少。
进一步机制分析显示，MRL/lpr小鼠肾组织中CARD6、RIP2和p-p65蛋白表达上调，而DHA处理可明显抑制这些蛋白表达。模型组肾组织中CARD6和RIP2共定位增强，DHA干预后这一现象减弱。同时，MRL/lpr小鼠肾组织中出现NF-κB p65核转位，DHA治疗后该过程受到抑制。这些结果共同表明，DHA可在MRL/lpr小鼠中阻断CARD6/RIP2/NF-κB信号通路，减少M1巨噬细胞浸润，从而改善炎症反应。
图6：二氢青蒿素（DHA）通过靶向CARD6并阻断RIP2/NF-κB信号通路，改善MRL/lpr小鼠肾功能异常。（a）通过PAS染色获得肾组织扫描图像。黑色箭头：肾小管排列紊乱和基质扩张；红色箭头：系膜免疫复合物沉积。H&E染色扫描图像中，黑色箭头表示炎症浸润，红色箭头表示肾小球系膜细胞增殖。Masson染色用于识别肾脏病理表型。黄色箭头表示肾小球萎缩和硬化，绿色箭头表示系膜增生和间质纤维化。所有病理图像放大倍数均为63×。比例尺为20 μm。（b）评估肾组织切片中IgG和C3沉积。图像放大倍数为60×。比例尺为10 μm。（c）肾组织切片中CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β、CARD6、RIP2、p65和p-p65的蛋白水平。（d）肾组织切片中CD86（红色）和F4/80（绿色）的双标免疫荧光分析。（e–h）肾组织切片中CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β、CARD6、RIP2和p-p65蛋白表达水平的定量分析。（i）肾组织切片中CARD6（红色）和RIP2（绿色）的共定位图像。（j）肾组织切片中NF-κB（红色）荧光信号。细胞核用DAPI染为蓝色。放大倍数为60×。比例尺为20 μm。每组n=5。<0.05表示与对照组相比差异显著；*P<0.05表示与MRL/lpr组相比差异显著。
CARD6沉默减轻MRL/lpr小鼠肾损伤，并削弱DHA的进一步作用
接下来，作者验证DHA是否直接通过靶向CARD6来缓解MRL/lpr小鼠肾损伤和炎症反应。由于前期研究显示MRL/lpr小鼠尿蛋白从第11周开始达到高峰，作者在11周龄MRL/lpr小鼠中采用AAV9系统进行肾脏原位注射，以沉默CARD6。
结果显示，CARD6敲低对MRL/lpr小鼠体重和肾脏指数没有显著影响。重要的是，敲低CARD6后，13周龄MRL/lpr小鼠的蛋白尿水平明显降低。与shRNA（CARD6）组相比，在CARD6沉默后再给予DHA处理，并未观察到统计学显著差异。进一步检测显示，CARD6缺失后，MRL/lpr小鼠血清血尿素氮和肌酐水平均下降；与shRNA（CARD6）组相比，DHA的抑制作用同样减弱。不过，模型小鼠血清中anti-dsDNA抗体、IFN-α和IFN-β水平并未因CARD6缺失而下降，提示CARD6敲低主要影响肾功能相关表型。
图7：敲低CARD6后，二氢青蒿素（DHA）对MRL/lpr小鼠的影响。（a）用于验证DHA在MRL/lpr小鼠中潜在机制的实验设计和干预流程。（b）沉默CARD6后，DHA（30 mg·kg−1）对MRL/lpr小鼠体重的影响。（c）CARD6缺失时，DHA（30 mg·kg−1）对MRL/lpr小鼠肾脏指数的影响。（d）敲低CARD6后，DHA（30 mg·kg−1）对MRL/lpr小鼠尿蛋白的影响。（e,f）CARD6缺失时，DHA（30 mg·kg−1）对MRL/lpr小鼠血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平的影响。（g–h）敲低CARD6后，通过ELISA检测MRL/lpr小鼠血清中anti-dsDNA IgG、IFN-α和IFN-β水平。每组n=5。<0.05表示与对照组相比差异显著；*P<0.05表示与shRNA（NC）组相比差异显著。
为进一步确认CARD6缺失的影响，作者评估了小鼠组织学变化、免疫复合物沉积和炎症反应。结果显示，CARD6敲低显著减轻MRL/lpr模型小鼠肾损伤，表现为肾组织结构恢复、基质扩张减少以及肾小球萎缩改善，同时IgG和C3免疫复合物沉积减少。与上述结果一致，在CARD6缺失后，肾脏中CARD6、iNOS、IL-1β和IL-6 mRNA表达显著下降，并伴随CD86、iNOS、TNF-α和IL-1β蛋白表达下调。与shRNA（NC）小鼠相比，CARD6敲低小鼠肾脏中F4/80和CD86阳性巨噬细胞积聚减少，提示CARD6缺失可缓解MRL/lpr小鼠炎症反应。
机制上，CARD6缺失显著降低CARD6、RIP2和p-p65蛋白表达，而在CARD6缺失背景下，DHA并未进一步干扰这些变化。此外，CARD6敲低破坏了CARD6与RIP2的共定位，并阻断NF-κB p65核转录；与之相一致，DHA对CARD6/RIP2/NF-κB信号通路的作用在CARD6缺失后被阻断。综合来看，CARD6敲低可显著减轻MRL/lpr小鼠肾损伤和炎症反应，而DHA正是通过靶向CARD6并阻断RIP2/NF-κB信号通路，改善MRL/lpr小鼠肾功能异常。
图8：二氢青蒿素（DHA）通过靶向CARD6并阻断RIP2/NF-κB信号通路，减轻MRL/lpr小鼠肾功能障碍。（a）通过PAS染色获得肾组织切片代表性图像，放大倍数为63×。比例尺为20 μm。黑色箭头：系膜免疫复合物沉积和炎症浸润；红色箭头：基质扩张。H&E染色扫描图像，放大倍数为60×。比例尺为20 μm。黑色箭头：炎症浸润；红色箭头：系膜细胞增殖。Masson染色用于识别病理表型，放大倍数为60×。比例尺为20 μm。红色箭头表示肾小球萎缩和硬化，黑色箭头表示系膜增生和间质纤维化。（b）肾组织切片中IgG和C3沉积的免疫染色。比例尺为10 μm。放大倍数为60×。（c）CARD6缺失后，检测MRL/lpr小鼠肾脏中CARD6、iNOS、IL-β和IL-6的mRNA表达。每组n=5。<0.05表示与对照组相比差异显著；*P<0.05表示与shRNA（NC）组相比差异显著。（d）肾组织中CARD6、RIP2、CD86、iNOS、TNF-α、IL-1β、Pro-IL-1β、p65和p-p65的蛋白表达。（e）肾组织中CD86和F4/80的双重免疫染色。比例尺为10 μm。放大倍数为60×。（f）采用免疫荧光和共聚焦成像分析CARD6（红色）与RIP2（绿色）的共定位图像，放大倍数为60×。比例尺为10 μm。（g）肾组织中NF-κB（红色）免疫荧光。细胞核用DAPI标记为蓝色。比例尺为10 μm。放大倍数为60×。
【贡献】★★★★★
综上，本研究在MRL/lpr小鼠中确认了DHA的肾脏保护作用，并提示靶向CARD6可能是治疗LN的一种潜在策略。该发现也表明，利用PROTAC技术识别天然化合物治疗靶点具有重要应用潜力。
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