多核苷酸变异（MNVs）指同一条单倍型上同时存在的两个或更多核苷酸变异，这类遗传变异在既往全基因组关联研究中常被忽视，多数研究仍将同一编码子或调控基序内的多个变异拆分为单个核苷酸变异（SNVs）分别解读。2026年8月8日，华中农业大学生物信息学团队龚静教授/牛晓辉副 教授课题组在《Nature Communications》在线发表了题为“Genome‑wide annotation of human multi‑nucleotide variants reveals widespread functional differences from single nucleotide variants”的研究论文。研究团队开发了名为MNVAnno的综合性工具箱，系统鉴定了来自700,134个人类样本的3,984,258个MNVs，并将人类MNV列表扩充至8,199,654个。他们通过整合gnomAD等公共数据与新鉴定MNVs，构建了人类MNV数据库HumanMNVdb，为遗传变异的功能解析提供了重要资源。
MNVAnno工具支持连续与非连续、多联MNVs的全基因组鉴定，研究团队将其与VarDict、BCFtools等五种现有工具进行了系统比较。在测试数据集中，MNVAnno识别的MNVs数量与其他工具存在显著差异，并且与金标准数据集的重叠率高达93.4%，F1分数也表现最佳。该工具的计算效率同样突出，运行时间和最大内存占用均远低于同类软件。这主要得益于MNVAnno采用了“高联优先”的合并策略，避免了将三联MNVs错误拆分为多个二联MNVs。他们还发现，不同工具识别MNVs数量差异巨大，VarDict结果最多而MACARON最少，这种差异源于支持的MNV类型、输入数据需求以及合并策略三个方面的不同。MNVAnno还额外提供了等位基因计数、等位基因频率和MNV基因型数据，并支持用户整合自定义注释库。
研究团队对MNVs的突变起源进行了系统分类，涵盖单核苷酸突变事件的组合、DNA聚合酶ζ介导的一步多核苷酸替换以及重复序列处的聚合酶滑动三种机制。在二联MNVs中，SNV事件占主导地位，但随着MNV联数增加，SNV事件比例下降，聚合酶滑动事件逐渐成为主要类别。他们进一步分析了二联MNVs的碱基变化模式，发现转换组合比颠换组合更易发生，尤其是CA→TG这种相邻二联替换。GC→AA和TC→AA两种模式在一类MNVs中显著富集，这些模式与pol‑zeta聚合酶特征一致，属于第二步复制错误类别。在编码区，37,207个位于同一密码子内的二联和三联MNVs中，有19,388个（52.11%）导致了与其组成SNVs完全不同的氨基酸改变。如果将这些SNVs单独注释，则多达53,981个（76.17%）SNVs面临错误注释的风险。这些MNVs分布于12,210个蛋白编码基因中，其中1,936个基因因MNVs引入了提前终止密码子，1,450个基因则发生了起始密码子移位。
在非编码区，研究团队发现MNVs对转录因子结合位点、非编码RNA二级结构和miRNA结合位点的影响同样显著且不同于其组成SNVs。他们预测了启动子区域MNVs对转录因子结合活性的改变，共鉴定出790,532个差异MNV‑TFBS对，其中26.87%为新生成位点，3.59%完全丢失。对于pre‑miRNA，287个（72.47%）位于pre‑miRNA内的MNVs改变了二级结构，且MNVs导致的自由能变化绝对值显著大于单个SNVs。3‘UTR区域的70,794个MNVs引起了320,545个差异miRNA结合位点对。他们还选取了非小细胞肺癌中表达较高的hsa‑miR‑585‑3p进行细胞实验，该miRNA种子区MNV转染组与野生型组相比，差异表达基因显著富集于p53和MAPK等癌症相关通路，其中86个基因的变化与靶标预测工具结果一致。研究团队利用UK Biobank数据对11种癌症进行了GWAS分析，鉴定出233个MNVs与癌症易感性显著相关，并发现两个位于DLC1和ABCA8基因内含子中的MNVs与肺癌患者预后相关。他们构建的HumanMNVdb数据库（https://gonglab.hzau.edu.cn/HMdb/）整合了MNVAnno工具、MNV列表以及MNV相关的TFBS、miRBS和ncRNA结构变化子数据库，并支持在线预测功能，为MNV功能机制研究提供了综合资源平台。
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