枸杞多糖（LBP）是从枸杞中提取的水溶性多糖，占枸杞干果的5%～8%。已有研究表明，无论是枸杞粗多糖还是纯化多糖，都具有广泛的生物活性。然而，关于LBP的现有研究大多集中在LBP的药效学，对于LBP的药代动力学研究尚不充分，严重限制了LBP作为药物和生物材料的进一步开发和应用。多糖分子结构复杂，天然活性多糖往往具有不同的分子质量分布、单糖组成及空间结构，难以明确单一成分多糖的吸收机制。同时，多糖缺乏紫外吸收和荧光基团，无法被紫外和荧光检测器检测到，且多糖的体内检测容易受到内源性多糖的干扰。因此，多糖的体内检测较为困难，需要采用合适的方法定性和定量监测血清和组织等生物样本。近年来，关于多糖的药代动力学及多糖代谢组学逐渐成为研究热点。目前，体内追踪多糖常用荧光标记法和同位素标记法。考虑到同位素具有放射性和半衰期，操作成本较高。因此，本实验选择菁染料（Cy7）和异硫氰酸荧光素（FITC）作为荧光标记染料。Cy7是一种近红外花青素荧光染料，具有高荧光亮度和光稳定性，FITC则具有高摩尔吸收率和荧光量子产率。成功建立多糖的荧光标记方法，对于研究多糖在体内的代谢模式（包括吸收、组织分布和排泄）具有重要作用。
华中农业大学食品科学技术学院，环境食品学教育部重点实验室，果蔬加工与品质调控湖北省重点实验室的向小青、任婧楠*和武汉市蔡甸区公共检验检测中心的李阳等人以前期热水提取、柱纯化得到的LBP（分子质量8.585×104 Da）为研究对象，利用生物交联技术将Cy7和FITC分别偶联到LBP上，研究小鼠口服LBP-Cy7后6 h内的组织分布和组织荧光强度，并检测小鼠口服LBP-FITC后在血浆中的药代动力学、组织分布和总排泄量。本研究旨在明晰LBP的体内药代动力学，弥补LBP在体内吸收分布研究中的空白，并为其他生物活性多糖的标记和检测分析提供参考。
1 荧光光谱分析
在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基团直接与蛋白多糖的氨基端发生亲核加成反应。多糖被Cy7标记时，在EDC/NHS的活化作用下，多糖的羧基端与Cy7的氨基端结合生成稳定的酰胺键。标记后多糖经过透析冻干，采用荧光分光光度计分别测量最大激发波长（Ex）和最大发射波长（Em），如图1所示，标记后的多糖与原标记染料具有相近的最大激发波长和最大发射波长，且标记物的最大激发波长和最大发射波长相比标记染料出现部分蓝移，表明标记产物制备成功。同时，标记过程中的碱性反应条件可能会改变多糖的电荷、构象及受体识别，因此该标记方法存在一定局限性。
2 荧光标准曲线及荧光标记率
由图2可知，FITC的荧光强度标准曲线方程为y＝0.860 2x+6.979 7，R2＝0.997 5，200 µg/mL LBP-FITC的测量荧光强度为636.8，代入标准曲线方程计算得到LBP-FITC的荧光标记率为0.32%。
3 体内成像
小鼠口服LBP-Cy7 24 h内的体内荧光成像如图3所示，多糖口服后首先集中在胃和肠道，并随着时间延长荧光强度逐渐降低。小鼠口服多糖后解剖取胃肠、肝、肾、脾、心、肺组织，可以观察到LBP-Cy7组在胃肠道和肝脏有明显荧光强度，并持续到12 h。与LBP-Cy7组相比，对照组Cy7在小肠和肝脏停留时间相对较短，说明Cy7在体内被迅速吸收并被肝脏代谢。Kaneo等的研究表明，多糖的分子质量大小对多糖的体内药代动力学有重要影响，分子质量高于40 kDa的多糖更容易长时间停留在肝脏中，而分子质量小于20 kDa的多糖则不容易在肝脏中聚集。因此，LBP-Cy7在肠道和肝脏的较长时间停留可能是由于LBP的大分子特性。
测量小鼠口服LBP-Cy7后小肠和肝脏在每个时间点的荧光强度，结果如图4所示。由于小肠较长，多糖经胃消化后在小肠中迅速累积，1 h时达到最大浓度，24 h后含量降到最低，在肝脏中的含量缓慢上升，在6 h达到最大浓度，24 h后基本被代谢清除。说明多糖经小肠吸收后主要在肝脏积累并被代谢。
4 血清、组织、尿液和粪便标准曲线
按照1.3.3.2节的方法，测定小鼠空白血清及加样后的荧光强度。以测得的荧光强度扣除空白样品的荧光强度为纵坐标，血清中LBP-FITC质量浓度为横坐标作图。经线性回归分析，LBP-FITC质量浓度在1～100 µg/mL 范围内线性良好，回归方程为y＝11.327x+6.874 9，R2＝0.998 2。
以小鼠各组织样品荧光强度扣除空白样品的荧光强度为纵坐标，各组织匀浆上清液中的LBP-FITC质量浓度（µg/mL）为横坐标作图。经线性回归分析，小鼠肝脏、肾脏、脾脏、胃、小肠、大肠、心和肺组织匀浆上清液中LBP-FITC质量浓度在1～100 µg/mL范围内线性良好，各组织标准曲线为：肝脏（y＝24.736x+64.015，R2＝0.989 8）、肾脏（y＝30.263x+139.150，R2＝0.996 2）、脾脏（y＝17.971x+22.641，R2＝0.995 1）、胃（y＝30.863x-20.799，R2＝0.999 5）、小肠（y＝35.890x+92.491，R2＝0.994 7）、大肠（y＝22.615x+25.650，R2＝0.987 9）、心（y＝28.238x-37.765，R2＝0.990 6）、肺（y＝26.777x-30.794，R2＝0.998 4）。
以小鼠尿液样品荧光强度扣除空白尿液荧光强度为纵坐标，各尿液中LBP-FITC质量浓度（µg/mL）为横坐标绘制标准曲线。经线性回归分析，小鼠尿液中LBP-FITC质量浓度在10～500 µg/mL范围内线性良好，回归方程为y＝25.422x+477.660，R2＝0.991 3。
以小鼠粪便样品荧光强度扣除空白粪便荧光强度为纵坐标，各粪便匀浆上清液中的LBP-FITC质量浓度（µg/mL）为横坐标作图。经线性回归分析，小鼠粪便匀浆上清液中LBP-FITC质量浓度在10～500 µg/mL范围内线性良好，回归方程为y＝28.966x+285.150，R2＝0.997 8。
5 精密度、稳定性、回收率分析
5.1 方法的精密度
配制5、20、50 µg/mL 3 种质量浓度的血清和组织样品以及20、100、500 µg/mL 3 种质量浓度的尿液和粪便样品。每种样品进行日内和日间测定，测定结果见表1。小鼠血清低、中、高浓度的日内RSD分别为4.93%、3.88%、1.45%，日间RSD分别为5.72%、4.39%、2.37%，血清低、中、高浓度的日内和日间RSD均低于15%，表明该方法具有良好的测量精密度。小鼠各组织测量日内RSD为1.08%～6.37%，日间RSD为1.54%～7.38%。尿液样品日内RSD为1.06%～4.52%，日间RSD为1.17%～4.67%。粪便样品日内RSD为1.07%～4.25%，日间RSD为2.24%～7.32%。
5.2 方法的稳定性
分别配制20 µg/mL的血清和组织样品，以及 100 µg/mL的尿液和粪便样品。每种样品室温放置24 h或4 ℃放置7 d后测定荧光强度，按照当日标准曲线计算样品的测定质量浓度，与理论质量浓度对比计算RSD。由表2可知，血清样品室温放置24 h RSD为11.93%，4 ℃放置7 d的RSD为12.37%；组织样品经室温24 h RSD在5.26%～14.62%，4 ℃放置7 d的RSD在4.59%～15.27%；尿液样品经室温24 h测量RSD为9.43%，经4 ℃放置7 d的RSD为12.58%；粪便样品经室温24 h测量RSD为13.49%，经4 ℃放置7 d的RSD为11.67%。说明血清、组织、尿液和粪便样品测量方法具有良好的稳定性，经过室温放置24 h和4 ℃保存7 d后样品RSD均在15%以下。
5.3 方法的回收率
分别测定小鼠5、20、50 µg/mL的血清和组织样品以及20、100、500 µg/mL的尿液和粪便样品的加样回收率。由表3可知，血清低、中、高浓度加样回收率为97.8%～100.8%，RSD为2.52%～3.60%；各组织样品加样回收率为97.2%～100.5%，RSD为1.05%～6.28%；尿液样品加样回收率为97.5%～98.9%，RSD为3.51%～4.82%；粪便样品加样回收率为97.7%～99.3%，RSD为3.19%～4.81%。各样品加样回收率均保持在95%～100%范围内，RSD＜15%，表明该方法加样回收率良好。
6 血清吸收、组织分布、排泄分析
6.1 血清吸收
小鼠灌胃给药50 mg/mL LBP-FITC，分别测定在0、0.5、1、2、3、4、6、8、12 h时的血清中LBP-FITC质量浓度。以血清中LBP-FITC质量浓度和对应时间点绘制平均药时曲线（图5）。
根据药代动力学数据分析得到的主要药代动力学参数见表4。小鼠口服50 mg/mL LBP-FITC后，药物在血清中的消除半衰期t1/2为（8.67±1.23）h，曲线下面积AUC0-24 h和AUC0-∞分别为（463.75±14.68）、（578.73±50.41）mg·h/L，最大峰质量浓度Cmax为（24.97±3.10）mg/L，最大峰浓度时间Tmax为（2.00±0.00）h。药代动力学参数t1/2表示药物在体内的消除速率，AUC值反映了药物进入血清循环总量。LBP-FITC在小鼠体内Tmax较短，而t1/2值偏大，这说明LBP-FITC在体内吸收迅速，而消除缓慢，这可能是由于LBP-FITC的大分子特性引起的。值得注意的是，该方法仅检测了血清中荧光的总信号，无法区分原型多糖、降解片段和游离染料，可能使结果被高估。因此，该方法尚有一定的局限性。
6.2 组织分布
单次灌胃小鼠50 mg/mL LBP-FITC后，分别在0、0.5、1、2、4、6、8 h时间点处死小鼠，测定LBP-FITC在各组织中的含量。由表5可知，给药后1 h内LBP-FITC主要集中于胃和小肠，随后含量逐渐降低。给药后1 h内LBP-FITC在肝、肾、脾、小肠、大肠、心和肺部位的含量都有上升趋势。与其他内脏相比，LBP-FITC在肝脏中有明显积累，6 h达到峰值含量，随后下降。给药过程中的LBP-FITC平均含量由高到低依次为小肠＞胃＞大肠＞肝＞肾＞肺＞心＞脾。在南瓜多糖和黑木耳多糖中也观察到相似的结果。吸收过程中LBP-FITC在脾、心和肺部含量整体较低，说明LBP-FITC在吸收过程中除在胃肠道停留外，主要分布于肝脏和肾脏。
6.3 排泄
小鼠单次灌胃50 mg/mL LBP-FITC后，分别收集不同时间段小鼠的所有粪便和尿液，并记录尿液和粪便的质量。以不同时间段尿液和粪便累积排泄量占给药量的百分率对时间作图（图6）。小鼠灌胃LBP-FITC后，在4～8 h排泄量最大，且主要通过粪便排泄，8 h时粪便中药物的总排泄量占给药量48.85%，8～24 h排泄速率迅速下降。给药48 h后，尿液和粪便中累积排泄的LBP-FITC占给药总量的87%，以粪便排出为主。在这个过程中，肠道微生物也可能发挥代谢作用，多糖可在肠道被发酵成短链脂肪酸，上皮吸收二次代谢产物或将它们运输到肝脏，从而影响多糖的药代动力学特征。
结 论
本研究通过荧光标记法成功制备了LBP-Cy7和LBP-FITC两种LBP荧光标记产物。分析了小鼠口服LBP-Cy7后的体内荧光强度，相比对照组Cy7，LBP-Cy7经口服后在小鼠体内停留时间较长，且主要在胃肠道和肝脏发现荧光分布。荧光强度结果表明，小肠在1 h时有最大荧光强度，肝脏在6 h时有最大荧光强度，表明多糖经小肠上皮细胞吸收后进入肝脏蓄积。随后考察了LBP-FITC测量方法的精密度、稳定性和回收率，结果表明该方法RSD均在15%以内。体内药代动力学、组织分布、尿液和粪便排泄结果表明，由于LBP-FITC的大分子特性，小鼠口服LBP-FITC后在血清中吸收迅速但消除缓慢。灌胃后LBP-FITC首先大量分布在胃、小肠、大肠，随后主要在肝脏积累，在6 h达到最大积累量，组织分布排序为小肠＞胃＞大肠＞肝＞肾＞肺＞心＞脾。小鼠单次灌胃LBP-FITC 48 h内，有87%通过尿液和粪便排出，且主要通过粪便排泄。本研究阐明了LBP在小鼠体内的吸收、分布和排泄特点，为LBP及其他生物活性多糖的药理学应用提供了参考依据。
引文格式：
向小青, 任婧楠, 李阳, 等. 荧光标记枸杞多糖在小鼠体内的药代动力学研究[J]. 食品科学, 2026, 47(11): 131-139. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251210-089.
XIANG Xiaoqing, REN Jingnan, LI Yang, et al. Pharmacokinetics of fluorescently labeled Lycium barbarum polysaccharides in mice[J]. Food Science, 2026, 47(11): 131-139. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251210-089.
实习编辑：杨瑞蕾；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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