2026年7月25日，甘肃中医药大学敦煌医学教育部重点实验室、甘肃中医药大学药学院、苏州大学系统生物学中心等单位研究团队在Phytomedicine（中科院1区，IF=11.3，TOP期刊）发表题为 “Qingfei Tongluo Formula attenuates COPD-associated ferroptosis by restoring arachidonic acid metabolic balance via dual inhibition of prostaglandin-endoperoxide synthase 2 and soluble epoxide hydrolase 2” 的研究论文。该研究由 Yanru Wang、Yawen Tian、Jiaxu Bai 等完成，通讯作者包括 Zhiming Zhang、Xiaojie Jin 和 Yongqi Liu。论文于2026年1月21日投稿，2026年5月9日修回，2026年5月13日接收，并于2026年5月16日在线发表。
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是一种以持续性气流受限和呼吸系统症状为主要特征的慢性肺部疾病，目前临床治疗主要以支气管扩张剂和吸入糖皮质激素缓解症状，但尚缺乏能够改变疾病进程的有效治疗策略。该研究围绕传统中药复方清肺通络方（Qingfei Tongluo Formula, QFTLF）展开，通过动物模型、多组学分析、单细胞RNA测序、计算机辅助药物设计（computer-aided drug design, CADD）以及实验验证等多层次研究，系统解析其治疗COPD的活性成分和分子机制。
研究发现，QFTLF能够改善COPD大鼠肺功能、肺组织病理损伤及系统性炎症反应，其作用机制与调控花生四烯酸（arachidonic acid, AA）代谢网络密切相关。QFTLF通过同时抑制前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2/COX-2）和可溶性环氧化物水解酶2（soluble epoxide hydrolase 2, EPHX2/sEH），并促进细胞色素P450 2J2（cytochrome P450 2J2, CYP2J2）表达，恢复11,12-EET与11,12-DHET之间的代谢平衡，从而降低炎症、氧化应激及铁死亡相关损伤。
此外，研究进一步利用CADD筛选及表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）实验验证了QFTLF入血原型成分与PTGS2/EPHX2的结合能力，最终确定了多个潜在关键活性化合物。其中，Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside同时表现出靶向PTGS2和EPHX2的潜力。
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【摘 要】
背景：
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）仍是全球重要健康负担之一，目前缺乏能够改变疾病进程的治疗方法。清肺通络方（Qingfei Tongluo Formula, QFTLF）作为经典中药复方，已显示出改善COPD相关症状的作用，但其具体分子机制及关键活性成分尚未明确。
目的：
本研究旨在解析QFTLF干预COPD的多靶点作用机制，并系统鉴定其发挥药效作用的关键入血活性成分。
方法：
研究首先建立COPD大鼠模型，对QFTLF的药效作用进行评价，并利用UPLC-MS/MS技术鉴定QFTLF血清原型成分。在此基础上，结合转录组学、蛋白质组学、基于PS-V2N的复杂网络分析以及单细胞RNA测序，筛选QFTLF调控的核心靶点、关键通路及作用细胞类型。随后利用计算机辅助药物设计（CADD），包括诱导契合分子对接（induced fit docking）、分子动力学模拟（molecular dynamics simulation）以及结合自由能计算，并结合SPR实验验证关键化合物与靶蛋白之间的相互作用。
结果：
药效学研究显示，QFTLF能够显著改善COPD大鼠肺功能、肺组织病理改变及系统性炎症水平，其作用效果与经典治疗药物氨茶碱（aminophylline, AML）相近。UPLC-MS/MS分析共鉴定出58种QFTLF入血原型成分。多组学整合分析及实验验证发现，QFTLF能够降低COPD大鼠肺组织以及香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract, CSE）诱导MLE-12细胞中的PTGS2和EPHX2表达，同时促进CYP2J2表达。
该调控作用恢复了花生四烯酸代谢平衡，提高具有抗炎和抗氧化作用的11,12-EET水平，并降低促炎及促氧化代谢产物11,12-DHET水平。同时，QFTLF降低炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，改善脂质过氧化指标（GSH、T-SOD降低以及MDA升高），并缓解铁死亡相关改变，包括Fe²⁺积累、HMGB1释放以及GPX4下降。上述作用主要涉及PTGS2–PPARγ–CYP2J2轴以及EPHX2相关通路调控。
进一步通过CADD和SPR分析发现，7种QFTLF血清活性成分具有较强的PTGS2或EPHX2结合能力，其中4种作用于PTGS2，包括Mudanpioside C、Baicalin、Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside；5种作用于EPHX2，包括Hamamelitannin、Choerospondin、Vitexin、Nepitrin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside。
结论：
本研究发现，清肺通络方是一种具有天然双靶向PTGS2/EPHX2作用特征的中药复方，其能够通过恢复花生四烯酸代谢平衡，减轻COPD相关肺上皮细胞铁死亡，从而改善COPD相关炎症和氧化损伤。研究进一步明确了QFTLF发挥作用的重要物质基础，为PTGS2/EPHX2联合调控策略及COPD植物药干预研究提供了依据。
01
研究背景及科学问题
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以持续性气流受限和呼吸系统症状为主要特征的进行性肺部疾病。随着全球人口老龄化加剧，COPD患病率和疾病负担持续增加。香烟烟雾（cigarette smoke, CS）等有害气体和颗粒长期暴露，是COPD发生发展的重要诱因，可导致持续性炎症反应、肺泡结构破坏以及小气道阻塞，最终造成不可逆性气流受限和肺功能下降。
目前COPD治疗主要依赖长效支气管扩张剂和吸入糖皮质激素等药物，这些治疗方案能够缓解临床症状，但无法阻止疾病进展或逆转已经形成的肺组织损伤。因此，寻找能够针对COPD核心病理机制的新型治疗策略仍是当前研究的重要方向。
慢性炎症和氧化应激被认为是COPD发生发展的核心病理过程。长期香烟烟雾刺激可诱导炎症因子释放，包括C反应蛋白、TNF-α、IL-6和IL-1β等，同时促进活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累并消耗抗氧化系统，形成持续性的炎症-氧化应激循环，加剧肺组织损伤。
近年来研究发现，铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性的程序性细胞死亡方式，在COPD病理过程中发挥重要作用。铁死亡主要表现为铁离子代谢异常、脂质过氧化物累积以及关键调控蛋白变化，例如GPX4、SLC7A11以及HMGB1等异常改变。氧化应激、炎症反应和铁死亡之间的相互作用，提示同时调控多个相关过程可能比单一靶点干预具有更好的治疗潜力。
花生四烯酸（arachidonic acid, AA）代谢异常被认为与COPD炎症、脂质过氧化及铁死亡密切相关。AA可通过环氧化酶（cyclooxygenase, COX）、脂氧合酶（lipoxygenase, LOX）以及细胞色素P450（cytochrome P450, CYP）等途径产生多种生物活性代谢物。其中，PTGS2/COX-2不仅参与炎症反应，也被认为是调节铁死亡的重要分子；而CYP2J2产生的环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids, EETs）具有抗炎和抗氧化作用，但可被EPHX2/sEH进一步代谢为具有促炎和促氧化作用的二羟基二十碳三烯酸（dihydroxyeicosatrienoic acids, DHETs）。因此，PTGS2、CYP2J2和EPHX2成为COPD干预的重要潜在靶点。
传统中药复方具有多成分、多靶点调控特点，为复杂疾病干预提供了新的研究方向。清肺通络方来源于经典方剂麻杏石甘汤，近年来被用于呼吸系统疾病治疗。然而，QFTLF治疗COPD的具体活性成分、作用靶点以及是否能够通过同时调控PTGS2和EPHX2发挥保护作用，仍缺乏系统研究。
因此，本研究通过血清药物化学、多组学整合分析、单细胞RNA测序、CADD计算预测、SPR验证以及体内外实验，系统解析QFTLF治疗COPD的物质基础和分子机制，重点探讨其双重调控PTGS2/EPHX2是否能够恢复花生四烯酸代谢平衡，并减轻COPD相关炎症、脂质过氧化和铁死亡。
02
重要发现及亮点
清肺通络方化学成分的UPLC-MS/MS系统鉴定
为了明确清肺通络方（Qingfei Tongluo Formula, QFTLF）的化学物质基础，研究人员首先采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS）技术，对QFTLF提取物进行系统性化学成分分析。
研究分别在正离子和负离子模式下获得QFTLF提取物的总离子流图（total ion chromatograms, TICs）。基于精确质量测定、MS/MS碎片信息以及与MWDB数据库中保留时间的匹配，共初步鉴定出442种化合物，其中包括正离子模式检测到的277种化合物以及负离子模式检测到的165种化合物。
这些化学成分主要包括172种黄酮类化合物、88种生物碱、64种酚酸类化合物、36种醌类化合物、17种木脂素和香豆素类化合物、8种萜类化合物、2种鞣质类化合物以及55种其他化合物。
研究进一步根据化合物在提取物中的丰度和稳定检测情况、与COPD炎症及氧化应激相关的药理活性、来源药材以及标准品可获得性，选择了5种代表性化合物作为定量标志物，包括：
Liquiritin
Rhamnocitrin
Chlorogenic acid
4-Hydroxybenzoic acid
Vanillin
这些标志物分别对应QFTLF组成药材中的相关来源，为后续药效研究和作用机制分析提供了化学基础。
图1：清肺通络方（QFTLF）的UPLC-MS/MS化学表征。
（A）采用正离子模式获得的QFTLF提取物代表性总离子流色谱图（TIC）。
（B）采用负离子模式获得的QFTLF提取物代表性总离子流色谱图（TIC）。
图中标注了5种代表性定量标志物，包括Liquiritin、Rhamnocitrin、Chlorogenic acid、4-Hydroxybenzoic acid和Vanillin，同时展示了这些化合物对应的保留时间以及来源药材。
清肺通络方改善COPD大鼠肺功能、组织损伤及炎症反应
为了评价QFTLF对COPD的整体药效作用，研究人员建立了脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）联合香烟烟雾（cigarette smoke, CS）诱导的COPD大鼠模型。
COPD模型建立成功后，将大鼠随机分为模型组（MOD）、氨茶碱阳性对照组（aminophylline, AML）以及不同剂量QFTLF治疗组，并连续给药28天，对体重变化、肺组织形态、呼吸功能、组织病理改变、炎症因子水平以及凝血指标进行综合评价。
研究发现，CS暴露导致COPD大鼠体重增长减缓，而QFTLF处理能够改善这一变化。与模型组相比，QFTLF能够缓解LPS和CS刺激导致的肺体积增大以及肺表面暗红色改变。
组织学分析显示，COPD模型大鼠出现明显的肺泡间隔破坏、支气管平滑肌增厚、支气管周围炎症细胞浸润、胶原沉积、血管平滑肌增生、杯状细胞化生以及黏液分泌增加等病理改变，而QFTLF治疗明显减轻上述组织损伤。
肺功能检测显示，模型组大鼠出现呼气流量（EF50、PEF）、呼气量（EV）、潮气量（TV）、肺泡容量（AV）以及吸气峰流量（PIF）下降，同时呼吸频率（F）升高；QFTLF处理可不同程度改善这些异常变化。
此外，QFTLF显著降低COPD大鼠血清中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平，并减少支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）中的细胞总数。同时，QFTLF改善了CS暴露导致的凝血指标异常，包括降低升高的纤维蛋白原（fibrinogen, Fib）水平，并逆转凝血酶原时间（prothrombin time, PT）和活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time, APTT）的下降。
上述结果表明，QFTLF能够改善COPD大鼠肺功能异常，减轻肺组织病理损伤，并降低系统性炎症反应。
图2：QFTLF缓解LPS和香烟烟雾（CS）诱导的COPD大鼠相关病理改变。
（A）COPD大鼠模型建立及给药流程。
（B）实验期间大鼠体重变化（n = 6）。
（C）各组大鼠代表性肺组织形态图片（n = 6）。
（D）肺组织HE染色、Masson染色以及AB-PAS染色代表性图片。
（E）呼吸功能评价（n = 6）。
（F）大鼠血清促炎细胞因子检测（n = 6）。
（G）大鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞总数检测（n = 4）。
（H）大鼠血浆凝血指标检测（n = 3）。
数据以mean ± SD表示。
*P < 0.05，**P < 0.01，与COPD模型组（MOD）相比。
清肺通络方入血原型成分鉴定及潜在活性物质筛选
由于中药复方具有多成分、多靶点特点，研究人员进一步对QFTLF进入血液循环中的原型成分进行分析，以明确其发挥药效作用的物质基础。
研究采用UPLC-MS/MS比较分析QFTLF提取物、空白血清以及QFTLF含药血清（QFTLF serum）的化学谱。
通过比较不同样品中的质谱信号，研究人员鉴定出QFTLF进入血液循环中的58种原型血清成分。
随后，研究人员进一步比较QFTLF提取物与含药血清中的化合物分类特征，并对这些入血原型成分进行分类分析，为后续靶点预测和机制研究提供候选活性物质。
图3：QFTLF来源原型血清成分的鉴定。
（A）QFTLF提取物、空白血清以及QFTLF含药血清在正离子（P）和负离子（N）模式下的叠加总离子流色谱图（TIC）。
（B）QFTLF提取物与QFTLF血清中化合物分类比较分析。
（C）QFTLF原型血清成分的鉴定及分类图。
多组学分析揭示清肺通络方干预COPD的潜在作用机制
为了进一步解析QFTLF改善COPD的分子机制，研究人员分别开展了转录组学和蛋白质组学分析，对正常对照组（CON）、COPD模型组（MOD）以及QFTLF治疗组肺组织样本进行系统比较。
在转录组分析中，研究人员首先筛选差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），并进一步关注在CON、MOD和QFTLF三组之间呈现特定变化趋势的基因。
结果显示，部分基因在COPD模型形成过程中发生异常改变，而QFTLF干预能够使这些基因表达趋势部分恢复。根据表达模式，研究人员筛选出具有“V型”（COPD模型组下降，QFTLF恢复升高）或“Λ型”（COPD模型组升高，QFTLF降低）变化趋势的关键基因，并进行聚类分析。
功能富集分析显示，这些趋势相关基因主要涉及炎症反应、氧化应激、代谢过程以及多种COPD相关信号通路。
随后，研究人员进一步开展蛋白质组学分析，筛选差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）。与转录组结果一致，部分蛋白在MOD组发生异常表达，而QFTLF处理能够逆转这些变化。
GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析进一步提示，QFTLF可能通过调控多种代谢和炎症相关通路发挥COPD保护作用。
图4：转录组和蛋白质组分析揭示QFTLF抗COPD的潜在作用机制。
（A）转录组分析获得的差异表达基因（DEGs）火山图（FC > 1.5或 < 1/1.5，p < 0.05）。
（B）筛选在CON、MOD和QFTLF组之间呈现“V型”（蓝色）或“Λ型”（粉色）表达趋势的差异表达基因。
（C）趋势显著差异表达基因的聚类热图。
（D、E）趋势显著差异表达基因的GO和KEGG通路富集分析（p < 0.05）。
（F）蛋白质组学获得的差异表达蛋白（DEPs）火山图（FC > 1.2或 < 1/1.2，p < 0.05）。
（G）筛选在三组之间呈现“V型”（蓝色）或“Λ型”（粉色）表达趋势的差异表达蛋白。
（H）趋势显著差异表达蛋白的聚类热图。
（I、J）趋势显著差异表达蛋白的GO和KEGG通路富集分析（p < 0.05）。
多模态数据整合锁定花生四烯酸代谢通路及关键调控靶点
为了进一步从多组学数据中筛选QFTLF发挥作用的核心机制，研究人员将转录组、蛋白质组以及QFTLF原型血清成分信息进行整合分析。
首先，通过Spearman相关性分析评价差异表达基因（DEGs）和差异表达蛋白（DEPs）之间的关联性。结果显示，部分基因和蛋白表现出较强一致性变化趋势（|r|≥0.7），提示其可能共同参与QFTLF调控过程。
随后，研究人员结合QFTLF原型血清化合物相关靶点信息，对多组学数据进行交叉分析，获得与QFTLF作用相关的关键靶点集合。
基于关键靶点进一步开展通路分析发现，花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）通路成为QFTLF干预COPD的重要候选机制。
进一步利用基于节点邻近度评分（proximity score of vertex to network, PS-V2N）的复杂网络分析，对关键通路中的核心调控基因进行优先级排序。
结果显示，花生四烯酸代谢通路中的多个关键基因与QFTLF作用密切相关。GSEA分析进一步证实，QFTLF能够显著调节COPD模型中的花生四烯酸代谢异常。
研究人员据此提出假设：香烟烟雾刺激导致花生四烯酸代谢失衡，而QFTLF能够通过恢复该代谢网络平衡发挥保护作用。
图5：多模态数据整合揭示QFTLF原型血清化合物相关核心通路和靶点。
（A）不同比较组中DEGs和DEPs的Spearman相关性分析（|r|≥0.7表示强相关）。
（B）整合调控通路相关基因和化合物相关基因后获得的关键靶点Venn图。
（C）基于关键靶基因显示的QFTLF原型血清化合物调控关键通路柱状图。
（D）基于原型血清化合物和关键通路构建的复杂基因网络PS-V2N节点邻近度评分。
（E）基于PS-V2N分析筛选花生四烯酸代谢通路中的关键基因。
（F）QFTLF组与MOD组比较中花生四烯酸代谢通路的基因集富集分析（GSEA），包括核心富集基因热图和蛋白互作网络（PPI）分析。
（G）香烟烟雾（CS）和QFTLF调控花生四烯酸代谢通路的机制假设图。
单细胞RNA测序确定花生四烯酸代谢相关靶点主要定位于肺上皮细胞
为了进一步明确QFTLF调控核心通路的细胞定位，研究人员利用人COPD患者肺组织单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据，对关键基因表达模式进行分析。
首先，研究人员利用UMAP（uniform manifold approximation and projection）降维分析鉴定出COPD患者肺组织中的8种主要细胞类型。
随后，通过scMetabolism分析评价不同细胞类型中的代谢通路活性。
结果显示，花生四烯酸代谢相关基因，包括：
PTGS2
EPHX2
CYP2J2
GPX4
主要表达于肺上皮细胞类型，尤其集中于肺泡Ⅱ型细胞（alveolar type II cells, AT2s）和纤毛细胞。
进一步分析显示，肺上皮细胞中的花生四烯酸代谢通路活性在COPD患者中发生改变，其中AT2细胞表现出明显差异。
研究结果提示，肺上皮细胞，尤其是AT2细胞，可能是QFTLF调控花生四烯酸代谢并改善COPD的重要作用细胞类型。
图6：单细胞RNA测序验证COPD患者中的核心通路和靶点，并确定关键作用细胞类型。
（A）COPD患者肺组织中鉴定出的8种主要细胞类型的UMAP可视化分析。
（B）基于scMetabolism分析不同细胞类型中排名前30位代谢通路活性的气泡图。
（C）不同细胞类型中PTGS2、EPHX2、CYP2J2和GPX4表达水平的小提琴图。
（D）肺上皮细胞scRNA-seq数据集中细胞分布的UMAP可视化分析。
（E）不同组别及肺上皮细胞类型中花生四烯酸代谢基因集的基因集变异分析（GSVA）富集评分。
（F）健康组和COPD组肺泡Ⅱ型细胞（AT2）中花生四烯酸代谢通路评分比较。
（G）不同细胞类型中PTGS2、EPHX2、CYP2J2和GPX4差异表达水平的小提琴图。
清肺通络方通过恢复花生四烯酸代谢平衡改善COPD肺组织铁死亡和炎症损伤
在多组学分析和单细胞RNA测序基础上，研究人员进一步在COPD动物模型中验证QFTLF对花生四烯酸代谢通路及相关靶点的调控作用。
研究首先检测COPD大鼠肺组织中的铁沉积情况。结果显示，LPS联合CS刺激导致肺组织铁离子沉积增加，而QFTLF治疗能够明显减少铁沉积。
进一步检测铁死亡相关指标发现，COPD模型大鼠肺组织中Fe²⁺水平升高，脂质过氧化指标异常，包括丙二醛（malondialdehyde, MDA）升高、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase, T-SOD）和谷胱甘肽（glutathione, GSH）水平下降；QFTLF干预能够逆转上述变化。
随后，研究人员检测花生四烯酸代谢产物变化。
结果显示，COPD模型中与炎症和氧化损伤相关的代谢平衡发生紊乱，而QFTLF能够调节花生四烯酸来源脂质代谢物水平，包括：
14,15-EET
14,15-DHET
11,12-EET
11,12-DHET
进一步免疫荧光分析显示，PTGS2和EPHX2主要定位于肺泡Ⅱ型细胞（AT2），QFTLF能够降低肺组织中PTGS2和EPHX2表达水平。
Western blot检测进一步证实，QFTLF调节PTGS2、EPHX2及其下游相关蛋白表达。
上述结果进一步支持QFTLF通过调节PTGS2/EPHX2相关花生四烯酸代谢网络，改善COPD肺组织铁死亡和炎症损伤。
图7：QFTLF在COPD中的花生四烯酸代谢相关保护机制的体内验证。
（A）肺组织铁沉积的PERLS-DAB染色分析（比例尺=20 μm）。
（B）QFTLF治疗后大鼠肺组织Fe²⁺水平检测。
（C）肺组织脂质过氧化相关指标检测，包括T-SOD、MDA和GSH。
（D）ELISA检测肺组织中花生四烯酸来源脂质代谢物，包括14,15-EET、14,15-DHET、11,12-EET和11,12-DHET。
（E）肺组织中PTGS2和肺泡Ⅱ型细胞标志物前表面活性蛋白C（pro-surfactant protein C, ProSPC）的免疫荧光染色（ProSPC，红色；PTGS2，绿色；DAPI，蓝色；比例尺=50 μm）。
（F）肺组织中EPHX2和ProSPC免疫荧光染色（ProSPC，红色；EPHX2，绿色；DAPI，蓝色；比例尺=50 μm）。
（G）肺组织PTGS2和EPHX2荧光强度定量分析。
（H）肺组织中PTGS2、EPHX2及下游通路相关蛋白Western blot分析。
QFTLF血清保护香烟烟雾诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤
为了进一步建立体外COPD相关细胞模型并研究QFTLF的直接保护作用，研究人员首先利用香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract, CSE）处理肺泡Ⅱ型上皮细胞。
研究采用CCK-8实验筛选CSE和QFTLF含药血清的最佳干预条件。
结果显示，CSE能够呈剂量和时间依赖性降低MLE-12和A549细胞活力。当MLE-12和A549细胞暴露于2.5% CSE 24小时后，细胞活力下降至约70%。
因此，研究人员选择2.5% CSE、24小时作为后续实验条件。
随后，研究人员评价不同浓度QFTLF血清对CSE诱导细胞损伤的保护作用。
结果显示，QFTLF血清能够浓度依赖性改善CSE导致的AT2细胞活力下降，其中MLE-12细胞保护作用更为明显。
进一步研究确定后续机制实验采用：
MLE-12细胞；
2.5% CSE；
24小时处理；
5%、10%、15% QFTLF血清浓度。
此外，研究人员进一步评价QFTLF对支气管上皮细胞B2B以及巨噬细胞RAW264.7损伤的影响，结果显示QFTLF能够不同程度改善CSE诱导的细胞活力下降。
图8：不同细胞类型中CSE和QFTLF血清最佳干预条件的确定。
（A–C）MLE-12和A549细胞暴露于CSE和/或QFTLF血清后的细胞活力检测，采用CCK-8实验评价。
（D–F）B2B和RAW264.7细胞暴露于CSE和/或QFTLF血清后的细胞活力检测。
（G）铁死亡相关调节剂Fer-1、Erastin和RSL3处理24小时后对MLE-12细胞活力的影响。
（H）不同药物处理24小时后MLE-12细胞活力变化。
（I）不同药物处理24小时后MLE-12细胞内Fe²⁺和GSH水平检测。
数据以mean ± SD表示（n ≥ 3）。
A和D组与0% CSE组比较；B和E组与10% FBS组比较；C和F组与对应CSE处理组比较；G–I组与Control组（*，**）或CSE组（#，##）比较。
*P < 0.05，**P < 0.01， < 0.05，# < 0.01。
QFTLF抑制CSE诱导的铁死亡和花生四烯酸代谢异常
在建立稳定的MLE-12细胞损伤模型后，研究人员进一步研究QFTLF血清是否能够抑制CSE诱导的铁死亡。
首先检测细胞内Fe²⁺水平。
结果显示，2.5% CSE刺激导致MLE-12细胞Fe²⁺明显积累，而QFTLF血清处理能够降低Fe²⁺水平。
随后，研究人员检测脂质过氧化相关指标。
结果发现，CSE刺激导致：
MDA水平升高；
T-SOD活性下降；
GSH水平降低。
而QFTLF血清能够显著改善上述氧化损伤指标。
进一步通过BODIPY 581/591 C11染色和流式细胞术检测脂质过氧化水平，结果显示QFTLF能够减少CSE诱导的脂质过氧化积累。
此外，ELISA检测花生四烯酸代谢产物发现，QFTLF能够调节14,15-EET、14,15-DHET、11,12-EET和11,12-DHET水平。
免疫荧光和Western blot结果进一步显示，QFTLF降低MLE-12细胞中PTGS2和EPHX2表达，并调节相关下游蛋白。
图9：QFTLF血清在CSE暴露MLE-12细胞中调控花生四烯酸代谢的体外验证。
所有实验均在QFTLF血清处理24小时后完成，除非另有说明。
（A）MLE-12细胞内Fe²⁺水平检测（n = 6）。
（B）脂质过氧化相关指标检测，包括MDA、T-SOD和GSH（n = 6）。
（C）MLE-12细胞BODIPY 581/591 C11染色检测脂质过氧化的代表性共聚焦图像。比例尺=50 μm（n = 6）。
（D）基于BODIPY 581/591 C11染色的流式细胞术脂质过氧化定量分析（n = 3）。
（E）ELISA检测花生四烯酸代谢物，包括14,15-EET、14,15-DHET、11,12-EET和11,12-DHET（n = 6）。
（F）MLE-12细胞PTGS2表达免疫荧光共聚焦图像（红色），细胞核采用DAPI染色（蓝色）。比例尺=50 μm。
（G）MLE-12细胞EPHX2表达免疫荧光共聚焦图像（红色），细胞核采用DAPI染色（蓝色）。比例尺=50 μm。
（H）PTGS2、EPHX2以及相关下游通路蛋白Western blot分析（n = 3）。
数据以mean ± SD表示。
*P < 0.05，**P < 0.01，与CSE（2.5%）组相比。
PTGS2和EPHX2药理学抑制模拟QFTLF抗铁死亡作用
为了进一步验证PTGS2和EPHX2是否参与QFTLF介导的保护作用，研究人员分别采用：
Celecoxib（PTGS2抑制剂）
GSK2256294A（EPHX2抑制剂）
作为药理学验证工具。
MLE-12细胞经2.5% CSE刺激，同时给予QFTLF血清、Celecoxib（25 μM）或GSK2256294A（25 μM）处理。
结果显示，与QFTLF类似，两种选择性抑制剂均能够：
降低CSE诱导的Fe²⁺积累；
减少MDA升高；
恢复GSH和T-SOD水平；
降低IL-1β和TNF-α表达；
恢复抗铁死亡蛋白GPX4表达。
这些结果表明，分别抑制PTGS2或EPHX2能够模拟QFTLF的核心保护作用，支持QFTLF通过双重调控PTGS2/EPHX2减轻CSE诱导的铁死亡、脂质过氧化和炎症反应。
图10：QFTLF血清及PTGS2/EPHX2抑制剂对CSE暴露MLE-12细胞铁死亡、脂质过氧化和炎症的影响。
（A）2.5% CSE条件下，MLE-12细胞经QFTLF血清、Celecoxib（25 μM）或GSK2256294A（25 μM）处理24小时后的细胞内Fe²⁺水平检测（n = 6）。
（B）处理24小时后MLE-12细胞脂质过氧化相关指标检测，包括MDA、T-SOD和GSH（n = 6）。
（C）处理24小时后MLE-12细胞中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α以及抗铁死亡蛋白GPX4的Western blot分析（n = 3）。
数据以mean ± SD表示。
*P < 0.05，**P < 0.01，与CSE（2.5%）组相比。
计算化学筛选确定靶向PTGS2和EPHX2的关键活性化合物
在明确PTGS2和EPHX2可能作为QFTLF治疗COPD的重要作用靶点后，研究人员进一步从QFTLF入血原型成分中筛选能够直接作用于这两个靶点的关键活性化合物。
研究首先利用计算机辅助药物设计（computer-aided drug design, CADD）方法，对58种QFTLF原型血清成分进行分子对接分析，并根据与PTGS2和EPHX2结合能力进行排序。
结果显示，部分原型化合物对PTGS2或EPHX2表现出较高预测结合能力。
随后，研究人员选取结合评分最高的20种候选化合物进行层次聚类分析，以进一步比较不同化合物与PTGS2及EPHX2之间的潜在结合模式。
进一步通过100 ns分子动力学模拟（molecular dynamics simulation, MDS）分析关键化合物-靶蛋白复合物稳定性。
研究通过均方根偏差（root mean square deviation, RMSD）和均方根波动（root mean square fluctuation, RMSF）评价复合物结构稳定性。
结果显示，PTGS2和EPHX2与关键候选化合物形成的复合物在模拟过程中保持相对稳定，提示这些化合物可能与靶蛋白形成稳定结合。
该分析为后续实验验证QFTLF关键活性成分提供了候选化合物基础。
图11：计算筛选和验证靶向PTGS2/EPHX2的关键化合物。
（A）QFTLF原型血清化合物中，与PTGS2和EPHX2分子对接评分最高的前20种化合物。
（B）与PTGS2进行分子对接的前20种QFTLF原型血清化合物层次聚类分析。
（C）与EPHX2进行分子对接的前20种QFTLF原型血清化合物层次聚类分析。
（D）PTGS2-关键化合物复合物在100 ns分子动力学模拟过程中的均方根偏差（RMSD）和均方根波动（RMSF）分析。
（E）EPHX2-关键化合物复合物在100 ns分子动力学模拟过程中的RMSD和RMSF分析。
SPR实验验证关键化合物与PTGS2/EPHX2直接结合能力
为了进一步验证计算预测结果，研究人员采用表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）技术检测候选化合物与PTGS2和EPHX2蛋白之间的直接结合能力。
实验结果显示，部分候选化合物能够与PTGS2蛋白产生明显结合响应，并获得相应的结合动力学参数，包括结合速率（association rate, kon）、解离速率（dissociation rate, koff）以及平衡解离常数（dissociation constant, KD）。
类似地，SPR检测也验证了部分化合物能够与EPHX2蛋白发生直接结合。
进一步结合分子作用模式分析发现，不同活性化合物可通过氢键、疏水作用等方式与PTGS2或EPHX2形成稳定相互作用。
综合计算预测和SPR验证结果，研究确定了能够靶向PTGS2和EPHX2的关键QFTLF活性化合物。
其中：
针对PTGS2的关键化合物包括：
Mudanpioside C
Baicalin
Vitexin
Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside
针对EPHX2的关键化合物包括：
Hamamelitannin
Choerospondin
Vitexin
Nepitrin
Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside
其中Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside同时表现出靶向PTGS2和EPHX2的潜力。
图12：关键PTGS2和EPHX2靶向化合物的实验验证及作用机制分析。
（A）SPR传感图显示关键化合物与PTGS2蛋白相互作用的代表性结合曲线、KD值以及结合/解离速率。数据表示为mean ± SD（n = 3），空白传感芯片未检测到显著结合响应。
（B）SPR传感图显示关键化合物与EPHX2蛋白相互作用的代表性结合曲线、KD值以及结合/解离速率。数据表示为mean ± SD（n = 3），空白传感芯片未检测到显著结合响应。
（C）关键化合物与PTGS2形成复合物后的结合相互作用模式分析。
（D）关键化合物与EPHX2形成复合物后的结合相互作用模式分析。
QFTLF及其PTGS2/EPHX2靶向活性成分改善COPD机制模型总结
在研究最后，作者基于上述实验结果总结了QFTLF治疗COPD的整体作用模式。
研究提出，QFTLF中的多种入血活性成分共同发挥作用，其中部分关键化合物能够直接靶向PTGS2和EPHX2。
通过调控PTGS2/EPHX2相关花生四烯酸代谢网络，QFTLF能够：
恢复花生四烯酸代谢平衡；
调节EET/DHET代谢比例；
减少脂质过氧化；
缓解铁离子积累；
抑制铁死亡相关损伤；
降低炎症反应。
最终，QFTLF改善COPD模型中的肺组织损伤和肺功能异常。
图13：QFTLF及其靶向PTGS2/EPHX2活性化合物抗COPD作用机制示意图。
该图总结了QFTLF及其PTGS2/EPHX2靶向活性化合物改善COPD相关病理过程的作用机制。
【贡献】★★★★★
本研究通过药效学评价、血清药物化学、多组学整合分析、单细胞RNA测序、计算机辅助药物设计以及实验验证等多层次策略，系统解析了清肺通络方（QFTLF）改善COPD的物质基础和分子机制。
研究发现，QFTLF能够改善LPS联合香烟烟雾诱导COPD大鼠的肺功能下降、肺组织病理损伤以及炎症反应。进一步研究表明，QFTLF的保护作用与调控花生四烯酸代谢异常密切相关。
机制研究显示，QFTLF能够同时作用于PTGS2和EPHX2两个关键靶点，降低PTGS2和EPHX2相关异常调控，并促进花生四烯酸代谢网络恢复平衡。同时，QFTLF能够改善COPD相关铁死亡，包括减少Fe²⁺积累、降低脂质过氧化水平以及恢复GPX4相关抗铁死亡防御。
此外，研究进一步鉴定了QFTLF入血原型成分中的关键活性化合物，并通过分子模拟和SPR实验验证其与PTGS2和EPHX2之间的直接结合能力。其中，Vitexin和Aloe-emodin-8-O-β-D-glucopyranoside同时具有靶向PTGS2和EPHX2的潜力。
综上，该研究提出了QFTLF通过“双靶向PTGS2/EPHX2—恢复花生四烯酸代谢平衡—抑制铁死亡”的作用模式，为理解中药复方干预COPD的分子基础提供了新的研究证据。
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