Acta Biomaterialia | 胥义团队提出类器官冻存创新策略：可控蒸发脱水协同低共熔溶剂实现三维细胞球体低毒高效低温保存|三维细胞|保护剂|冻存|脱水|蛋白|高浓度

类器官与三维细胞球能再现体内微环境与细胞外基质（ECM）网络，在疾病模拟、药物筛选与再生医学中具有不可替代的价值【1,2】。但致密的三维结构也带来严重的传质障碍：冷冻保护剂（Cryoprotectant, CPA）难以扩散至球体核心，传统冻存只能依靠高浓度CPA溶液保证渗透，由此产生的极端浓度梯度会对细胞球施加剧烈渗透应激，而“保护效果”与“细胞毒性”之间的取舍长期难以调和【3,4】。低共熔溶剂（DES）因其组分设计灵活、热物性可调、生物相容性良好以及温度敏感流变特性，被视为新一代可设计型的冷冻保护剂，但其高黏度的超分子网络本身也是一道传质阻碍【5】。如何降低传质阻力并缓解高渗损伤，是三维样本低温保存需要解决的核心问题。

近日，上海理工大学健康科学与工程学院胥义教授团队在ActaBiomaterialia发表题为Synergistic proline-based deep eutectic solvent enables low-toxicity microdroplet cryopreservation of 3D cell spheroids的研究文章。作者以NIH/3T3细胞球为可重复的三维模型，提出将L-脯氨酸基DES与微液滴受控蒸发脱水（Controlled Evaporative Dehydration, CED）相融合的低毒冻存方案，并以低浓度DMSO构建二元协同体系PE13-D：在CED 4 min时取得约93%的复温存活率，较传统慢速冻存（10% DMSO）提高约30个百分点，为三维生物样本的低温保存提供了通过材料设计降低高浓度保护剂依赖的新思路。

DES由氢键受体（HBA）与氢键供体（HBD）按特定化学计量比组成。团队以L-脯氨酸为HBA、葡萄糖和乙二醇为HBD，合成了三种L-脯氨酸基DES——PG53（5:3）、PG11（1:1）与PE13（1:3）。热力学与冷冻显微观察显示，DES溶液的熔化焓显著低于DMSO、冰晶生长也远慢于PBS，说明其强氢键网络有助于限制水分子运动，并降低冰晶成核与生长倾向。10% PE13与3T3细胞球共培养24 h后存活率仍稳定在90%。综合冰晶调控能力与生物相容性，PE13因此被选为后续复合保护体系的主要DES组分。

加载方式上，作者引入微液滴CED技术（−0.09 MPa、4 ℃），以避开传统高浓度CPA加载带来的剧烈体积变化。蒸发过程中水分子逸出、低蒸气压溶质在液滴内原位浓缩：纯DES微液滴10 min内浓度仍低于1 M，引入DMSO后束缚水被释放，浓度上限提升至约2.5 M，使体系进入更有利于形成玻璃化倾向状态的浓度范围。细胞球的体积响应也表明，PE13主要在细胞球外部形成保护性微环境，并促进温和渗透脱水，加载过程平缓；但持续脱水会使渗透应激急剧升高，研究因此确定了本研究条件下4–6 min的较优CED预脱水窗口，该窗口内PE13-D处理细胞球的复温存活率超过90%。作者强调，该窗口针对的是本研究的配方与工艺条件，并非普适的固定时长。

冻存效果上，单纯以PE13作为保护剂时虽然加载相容性良好，但冻存后存活率低于30%；引入低浓度DMSO构建的二元体系PE13-D则显著提升，且强烈依赖蒸发时间——CED 4 min时复温存活率约为93%（作为内部对照，而PG53、PG11等单一DES体系冻存效果有限）。结构验证与之一致：复温后PE13-D组相邻细胞球自第2天起即出现明显的组织重塑，第3天已自发迁移融合为致密、形态均一的球体，细胞核与细胞骨架形态保持良好、凋亡信号极少。原文也提示，因生物模型与配方各异，与既往报道的数值不应作直接比较。

机制层面，作者通过定量蛋白质组学对低损伤与重损伤表型作了发现性对比，差异蛋白显著富集于p53信号、谷胱甘肽代谢与铁死亡等通路；GSH/GSSG分析与Fer-1干预实验均提示，PE13体系的抗氧化能力更强、铁死亡相关氧化损伤更轻。蛋白层面，PE13下调介导外源铁摄取的TFR1、上调促进胞内铁储存的FTH1，并下调促脂质过氧化的ACSL4、上调铁死亡核心抑制因子GPX4。作者据此提出跨尺度保护框架：PE13在细胞球尺度缓冲渗透波动，并通过改善铁稳态和抗氧化响应减轻氧化损伤。但作者也指出，这些结果支持铁死亡相关氧化应激的参与，并未确立其为唯一或主导机制。

总体而言，本研究以NIH/3T3细胞球为主要模型，并以肝细胞球（HLOs）作了初步的跨细胞类型验证：在本研究条件下，CED 4–6 min为最优预脱水窗口，PE13-D组兼具较高的复温存活率与结构完整性。该工作为类器官与组织工程构建物的低温保存提供了方法学基础，也为降低复杂三维生物样本的保护剂暴露与冻存损伤提供了新路径。作者也指出，NIH/3T3细胞球与HLOs尚不能完全代表干细胞或患者来源类器官的复杂性，后续需在更具代表性的样本中验证，并推动该体系与微流控平台的集成以实现规模化存储。

上海理工大学健康科学与工程学院陈曦为第一作者，胥义教授为通讯作者。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.actbio.2026.09.032

制版人：十一

参考文献

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2. M. Xu, D. Kong, S. Sun, Y. Wang, G. Su, S. Zhang, J. Yan, Z. Han, J. Li, L. Zhang, Organoids for disease modeling and treatment: state-of-the-art,Exp.Hematol. Oncol.15 (1) (2026) 10.

3. H. Han, T. Zhan, N. Guo, M. Cui, Y. Xu, Cryopreservation of organoids: strategies, innovation, and future prospects,Biotechnol. J.19 (2) (2024) 2300543.

4. B.P. Best, Cryoprotectant toxicity: facts, issues, and questions,Rejuvenation Res.18 (5) (2015) 422–436.

5. W. He, T. Zhan, H. Han, Y. Xu, Optimization of deep eutectic solvents enables green and efficient cryopreservation,Langmuir40 (1) (2024) 624–637.

学术合作组织

（*排名不分先后）