生物聚合物也能“原子级定制” ：RFdiffusion3 让 AI 直接摆原子
设计一种全新酶，难点不只是把蛋白质骨架折出来，而是要把催化反应所需的几个关键原子精确摆到合适位置：金属离子要配位，氢键要接上，底物要朝向正确，甚至还要考虑翻译后修饰。过去不少生成式蛋白质设计方法主要在氨基酸残基层面“搭骨架”，能设计单体、组装体和结合蛋白，却难以精细指定酶活性位点以及小分子、核酸之间的原子级相互作用。RFdiffusion2 虽然能把少量催化侧链原子作为条件，但扩散仍在残基水平，无法顺便创造新的侧链相互作用；RNA 和 DNA 设计方法也多在残基水平，给从头设计核酶的功能位点支架化带来困难。核心问题由此浮现：能不能直接以原子为单位，把蛋白质、RNA、DNA 以及小分子配体放在同一个生成框架里设计？
方法：用原子级“施工图”
华盛顿大学西雅图分校David Baker教授、Rohith Krishna博士合作，开发出RFdiffusion3（RFD3）给出的答案，是把“原子”作为基本单位，用自由原子扩散从随机原子云逐步去噪成结构化生物聚合物（图1）。模型将蛋白质残基统一表示为 4 个骨架原子加 10 个侧链原子，把核酸也纳入同一套原子表示，最多用 23 个原子槽位覆盖蛋白质加核酸的一般情况；对半胱氨酸/丝氨酸等等排残基和碱基 C/U 等等排单元，则用不同的虚拟原子索引加以区分。模型采用类似 AlphaFold3 扩散模块的 transformer U-Net 架构，但大幅瘦身：把 Fairformer 从 48 层缩到 2 层，最终网络只有 1.68 亿个可训练参数，并省略计算昂贵的三角乘法和三角注意力更新，再在扩散步中引入循环机制（图1c）。这让 RFD3 不但在全原子层面生成结构，而且推理更快（图1d）。 更关键的是，RFD3 可以接受原子级条件：哪些催化原子要固定、哪些原子要埋藏、哪里需要氢键、配体朝哪个方向、核酸碱基如何配对，都可以作为“原子级施工图”输入（图1b 展示其中部分条件）。设计者不必预先指定催化残基在序列中的位置，而由模型在生成过程中同时推断支架结构、侧链旋转异构体和催化残基在序列中的位置；最终蛋白序列由 ProteinMPNN/LigandMPNN 设计，RNA 序列可直接由模型生成。相关论文以“Atomic functional site scaffolding in biopolymers with RFdiffusion3”为题，发表在Science上。
图1. RFdiffusion3 的全原子设计。
通用：蛋白和 RNA 一起设计
方法上的“原子化”也带来了任务上的通用性。RNA 设计方面，RFD3 在 Eterna OpenKnot 基准的 57 个 RNA motif 条件化谜题中，表现出比 RFDpoly 更高的三维结构-序列共设计能力：LDDT 大于 0.9 的谜题有 21 个，而 RFDpoly 为 10 个；RMSD 小于 4 Å 的谜题有 9 个，而 RFDpoly 为 5 个（图2b）。AF3 对 RFD3 共设计的非经典碱基对几何的重现率也高于对 RFDpoly 设计的重现率，例如糖边-经典边配对约 50%。针对 AMP 和 FMN 的 RNA 适配体设计也获得了计算机可验证的成功案例：每个靶标生成 1200 个设计，在 4 Å 配体 RMSD 阈值下约 1%、8 Å 阈值下约 25% 的计算机成功率（图2g、图2h）。这说明，RFD3 不只是“画蛋白”，而是能把 RNA 的功能位点也放到原子级框架里一起设计。
图2. RFdiffusion3 的核酸共设计。
基准：复杂活性位点也能搭
酶设计是更能体现方法价值的场景。RFD3 在 Mechanism and Catalytic Site Atlas 的原子 motif 酶支架化基准上，41 个任务中有 37 个优于 RFD2，在更难的问题上通过率更高；对醛缩酶、鸟氨酸脱羧酶、糖苷酶和磷酸三酯酶这四个各含 6 个催化残基的活性位点，RFD3 都能生成更多在重折叠后活性位点残基重现到 1.25 Å 以内的设计（图3d、图3e）。它还能在生成过程中显式强制 C2 对称性，生成对称酶复合物；甚至能把 RNA 和蛋白质残基共同贡献的核糖核酸酶 P 活性位点作为杂合 motif 来支架化（图3g）。RFD3 的方法核心不是“先有序列再折叠”，而是“先给出功能所需的原子关系，再让模型长出合适骨架，并配合序列设计方法确定序列”。
图3. 使用 RFdiffusion3 的酶计算机设计。
验证：96 个设计找到磷酸三酯酶
实验验证把这种方法从计算机推到了试管里。研究团队选择对氧磷作为模型底物，设计磷酸三酯酶：目标活性位点包含 6 个催化残基、两个 Zn(II) 离子，以及一个需要翻译后氨基甲酰化的赖氨酸（图4b）。RFD3 为每个理论活性位点模型（theozyme）生成支架，再用 LigandMPNN 设计序列，并筛选 AF3 和 Chai-1 预测能重现活性位点几何的设计。首轮 96 个设计中鉴定出 4 个活性设计，均来自同一基础支架；最活跃的 ZAPP-1 能进行多轮转化，kcat 为 0.015±0.003 s⁻¹，kcat/KM 为 2.0±0.6 M⁻¹ s⁻¹（图4e）。它和 AF3 预测的翻译后修饰蛋白-金属-底物复合物几乎一致，Cα RMSD 仅 0.53 Å（图4c）。更关键的是，敲除全部六个催化残基后活性完全或大幅丧失，支持设计活性位点确实介导了反应（图4f）。 第二轮设计又筛选 192 个设计，表征了跨越 4 个不同支架的 7 个活性命中，其中 ZAPP-2 的 kcat 达到 0.023±0.006 s⁻¹，kcat/KM 为 4±3 M⁻¹ s⁻¹，速率增强为 (5±2)×10⁵（图4h、图4i）。同一催化问题能长出多种结构解决方案，说明 RFD3 不是只复现一个“标准答案”。
验证：面向 TTR 的锌蛋白酶
另一条实验线是针对人类转甲状腺素蛋白（TTR）的锌蛋白酶设计。TTR 的错误折叠和聚集与系统性 TTR 淀粉样变性相关。研究团队选择 TTR 纤维核心最长 β 链上的 PAINVAHVHF 作为目标表位（图4j），把催化残基、底物骨架原子和稳定蛋白酶骨架原子组合成 theozyme 输入 RFD3（图4k），让模型同时支架化催化残基、确定底物构象并生成定制活性位点裂隙。96 个设计酶中，56 个在顺式实验中于 37°C 孵育 18 小时后经 SDS-PAGE 分析显示超过 10% 的切割；进一步用 FRET 报告体系选出最佳命中 TTRg4、TTRg10 和 TTRg11，其中 TTRg11 能在 1 小时内切割大部分底物，SDS-PAGE 凝胶分析确认（图4m），质谱进一步验证切割位点。TTRg11 对同源底物的活性明显高于其他 β-淀粉样蛋白生成蛋白的六个序列（图4n），并依赖 Zn(II)（图4o）。作为没有经过实验优化的“一次设计”蛋白酶，它的 kcat 为 0.072±0.008 s⁻¹，KM 为 70±10 μM，kcat/KM 为 1100±300 M⁻¹ s⁻¹（图4p），落在具有明确生物学功能和广泛应用的自然蛋白酶范围的低端。
图4. 使用 RFdiffusion3 设计磷酸三酯酶和金属蛋白酶。
结论：从残基级到原子级
从方法到结论，RFD3 的意义可以凝练为一句话：它把生物聚合物功能位点设计从“残基级”推进到了“原子级”。 统一的 23 原子表示让蛋白质和核酸可以在同一个模型里被支架化；原子级条件让催化原子、氢键、埋藏程度、配体方向和对称性都能直接进入生成过程；轻量架构则让推理更快。实验上，磷酸三酯酶和 TTR 蛋白酶都从 96 个设计中获得了有活性的催化剂，且磷酸三酯酶案例还涉及双金属、翻译后修饰和柔性底物等复杂因素。研究结论认为，RFD3 管线能够精确支架化蛋白质、核酸以及蛋白质-核酸杂合体中的原子星座，生成此前结构生成方法难以设计的酶，并有望广泛用于多种生物分子设计挑战和应用。
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