《食品科学》：成都大学何洪博士、王金秋副教授等：鸡蛋清蛋白质糖肽的结构鉴定|何洪博|基化|活性|王金秋|糖蛋白|食品科学|鸡蛋清蛋白质糖肽的结构鉴定

鸡蛋被认为是最佳的膳食蛋白质来源，是食用人群最广泛、食用频次最高的食物之一。鸡蛋清中超过80%的蛋白质存在糖基化修饰，主要蛋白质（卵黏蛋白、卵白蛋白、卵转铁蛋白和卵类黏蛋白）均为糖蛋白。糖基化是最普遍、最丰富的蛋白质翻译后修饰，主要包括N-糖基化修饰和O-糖基化修饰。N-糖基化修饰大多发生在保守序列Asn-Xxx-Ser/Thr（Xxx为非脯氨酸的任何氨基酸）中的天冬酰胺残基上，O-糖基化修饰则多发生在丝氨酸/苏氨酸残基上。

成都大学食品与生物工程学院的蔡芝鸿、何洪*、王金秋*等分别富集了鸡蛋清N-糖肽和O-糖肽，然后运用液相色谱-质谱联用技术全面解析鸡蛋清完整糖肽的结构信息，进一步借助生物信息学分析方法探究鸡蛋清糖蛋白对肠道的潜在作用，以期为深入探究蛋清糖肽对肠道的潜在作用提供了重要的结构信息。

鸡蛋清蛋白质的N-糖基化鉴定结果

采用液相色谱-质谱联用对鸡蛋清蛋白质经胰蛋白酶酶解和HILIC柱富集获得的蛋清糖肽进行N-糖基化分析。结果表明，共鉴定到1 720 个完整N-糖肽结构，涉及99 个N-糖基化位点和49 种N-糖蛋白（图1A）。大部分肽段带2～3 个电荷，肽段主要分布在7～30 个氨基酸范围内。蛋白质糖基化修饰具有宏观和微观异质性，即糖蛋白含有多个糖基化位点，以及同一修饰位点可以连接多条糖链。在鉴定到的N-糖蛋白中，85.7%的糖蛋白含有1～2个N-糖基化位点，其中29 个糖蛋白仅含有1 个N-糖基化位点，仅1个糖蛋白含有5 个以上N-糖基化位点（图1B）。此外，共有51个N-糖基化位点（51.5%）共价连接的糖链超过5条，23个N-糖基化位点（23.2%）连接的糖链只有1 条，以及25个N-糖基化位点（25.3%）连接了2～5 条糖链（图1C），这表明N-糖蛋白具有高度微观异质性。N-糖基化修饰的糖链具有共同的五糖核心结构：2 个N-乙酰葡萄糖胺和3 个甘露糖。本研究将N-糖基化修饰鉴定到的糖型划分为5 类：高甘露糖型、低甘露糖型、岩藻糖型、唾液酸化型和复杂型/杂合型。其中复杂型/杂合型糖链占比最高（40%），其次是岩藻糖型糖链（26.3%），而低甘露糖型糖链占比最少（7.3%）（图1D）。糖肽是糖链与多肽相结合的大分子化合物，由于糖链结合的多肽及多肽上的位点不同，通常认为一条糖链对应一个糖肽结构。因此，综合上述结果分析表明，鸡蛋清蛋白质消化后将产生结构多样的N-糖肽。

鸡蛋清蛋白质的O-糖基化鉴定结果

采用液相色谱-质谱联用对鸡蛋清蛋白质经胰蛋白酶酶解、Retain AX柱和AminoLink树脂富集和O-糖蛋白酶酶解获得的蛋清糖肽进行O-糖基化分析。结果表明，共鉴定到565 个完整O-糖肽结构，涉及90 个O-糖基化位点和29 种O-糖蛋白（图2A）。获得的肽段大部分带2～3 个电荷，肽段主要分布在7～20 个氨基酸范围内。此外，在鉴定到的O-糖蛋白中，75.8%的糖蛋白含有1～2 个O-糖基化位点，17.2%的糖蛋白含有5 个以上O-糖基化位点（图2B）。与N-糖基化修饰相比，蛋清蛋白质O-糖基化修饰的糖基化位点数量相接近，但糖链结构较少，这表明鸡蛋清蛋白质的O-糖基化修饰的微观异质性相比N-糖基化修饰较低。例如，O-糖基化修饰的蛋白质中有40 个O-糖基化位点（44.4%）共价连接的糖链只有1 条，22 个O-糖基化位点（24.4%）连接的糖链超过5 条（图2C）。由于O-糖基化修饰没有共同的核心糖链结构，其糖型分析相较N-糖基化糖型分析更为复杂。本研究将O-糖基化修饰鉴定到的糖型划分为4 类：唾液酸化型、己糖型、岩藻糖型和N-乙酰己胺型。其中唾液酸化型和己糖型修饰的O-糖链占比相似且较高（分别为33.1%和32.9%），其次是岩藻糖型修饰的O-糖链（24.5%），而N-乙酰己胺型修饰的糖链占比最少（9.5%）（图2D）。

与Cavallero等鉴定到的98 个N-糖肽结构相比，本研究鉴定到的完整N-糖肽结构数量增加了16.55 倍。尽管都采用胰蛋白酶酶解和HILIC柱富集蛋清糖肽，但由于本研究采用了高蛋白覆盖深度和高灵敏度的串联质谱分析，鉴定到的蛋清N-糖肽结构数量更多。此外，Landoni等对蛋清蛋白质的O-糖基化进行分析，共鉴定到至少7 种O-糖基化蛋白质；进一步采用还原β-消除法释放出卵白蛋白的糖链并分析其O-糖基化结构，发现卵白蛋白含有2 种O-糖肽，其中一种携带6 种不同的糖链结构；然而，未鉴定出完整的蛋清O-糖肽结构，本研究通过Retain AX柱和AminoLink树脂富集获得了565 个蛋清完整O-糖肽结构。

主要鸡蛋清蛋白质的糖肽结构分析

3.1 卵黏蛋白

卵黏蛋白作为蛋清中重要的高度糖基化大分子蛋白质，占蛋清总蛋白质的3.5%，由α-卵黏蛋白（含15%碳水化合物）和β-卵黏蛋白（含60%碳水化合物）2 个亚基组成。本研究鉴定到卵黏蛋白糖肽在蛋清糖肽中的丰度最高，占总糖肽的30.9%，包括490个完整N-糖肽结构，涉及21个N-糖基化位点；216个完整O-糖肽结构，涉及27 个O-糖基化位点（图3）。表1列出了卵黏蛋白主要N-糖肽（第1～20行）和O-糖肽（第21～40行）的信息。对于N-糖基化修饰，卵黏蛋白的糖链结构主要为复杂型/杂合型（46.4%），即高度分支和高分子质量的复杂结构。对于O-糖基化修饰，除了N-乙酰己胺型，其他3 种糖型（岩藻糖型、己糖型和唾液酸化型）的含量均较高，分别占总O-糖型的25%、32%和36%。

卵黏蛋白复杂的糖链结构不仅可通过增大分子空间位阻影响其三维折叠和构象，提高卵黏蛋白对水解酶的抗性和分子稳定性；还可以增强卵黏蛋白的黏附能力，有利于发挥乳化和稳定界面的功能。此外，卵黏蛋白的N-糖基化和O-糖基化均含有丰富的唾液酸化型糖链结构，分别为41 种和78 种，相比Zhang Xin等通过碱性β-消除法处理后鉴定到的卵黏蛋白中唾液酸化型O-糖链（约25 种）更多。研究表明，卵黏蛋白的抗病毒感染活性与唾液酸修饰的糖链有关。Kobayashi等采用链酶蛋白酶水解卵黏蛋白获得糖肽，发现糖肽能够与大肠杆菌O157:H7结合，但去唾液酸化处理后失去了这种功能。卵黏蛋白丰富的N-/O-糖基化位点及复杂的糖链结构，可能与其理化特性和生物学功能活性密切相关。值得注意的是，Offengenden等利用纳米液相色谱-电喷雾离子源质谱、串联质谱和MALDI MS鉴定到鸡蛋清α-卵黏蛋白和β-卵黏蛋白分别含有15 个和2 个N-糖基化位点，Cavallero等通过超高效液相色谱-电喷雾电离-轨道阱质谱-高能碰撞解离鉴定到卵黏蛋白在N1841位点的1 种糖链结构和N303位点的4 种糖链结构。因此，与先前的研究相比，本研究提供了更多关于卵黏蛋白糖肽的结构信息。

3.2 卵转铁蛋白

卵转铁蛋白约占鸡蛋清总蛋白质的12%，含有686 个氨基酸残基，是主要的生物活性糖蛋白，具有抗菌、抗癌、抗病毒和抗氧化等多种生物功能活性。如图4所示，本研究共鉴定到卵转铁蛋白的2 个N-糖基化位点（N484和N629），共12 种N-糖肽结构。卵转铁蛋白的N-糖链结构具有高度的复杂性和异质性，包括4 种糖型（复杂型/杂合型、岩藻糖型、唾液酸化型和高甘露糖型），其中复杂型/杂合型的占比最高，为50%。然而，目前还没有关于卵转铁蛋白O-糖基化修饰的结构鉴定研究。本研究共鉴定到卵转铁蛋白的3 个O-糖基化位点（T103、S159和S161），共3 种O-糖肽结构。与N-糖基化修饰相比，卵转铁蛋白的O-糖基化修饰的位点更多，但O-糖链结构较少，仅含有2 个N-乙酰己胺型和1 个唾液酸化型O-糖链结构。

研究发现，卵转铁蛋白的消化产物可能具有较高的潜在致敏性，这或许与卵转铁蛋白的糖基化修饰有关。然而，卵转铁蛋白诱导过敏反应的具体分子机制仍有待进一步阐明。此外，乳铁蛋白广泛分布于乳汁和各种分泌液中，是先天防御系统的关键组成成分，参与天然免疫。与乳铁蛋白相比，卵转铁蛋白的N-糖基化修饰位点和N-糖链结构较少。此外，本研究首次鉴定到了蛋清卵转铁蛋白的3 种O-糖肽结构。

3.3 卵白蛋白

卵白蛋白是一种磷酸化糖蛋白，在鸡蛋清中含量最丰富，占54%。卵白蛋白相关蛋白X的氨基酸序列与卵白蛋白高度相似（77%），属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。此外，卵白蛋白相关蛋白Y与卵白蛋白相关蛋白X的序列同源性高达71%，也属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。如图5所示，本研究鉴定到卵白蛋白（P01012）的7 个O-糖基化位点，涉及20 个O-糖肽结构，含有3 种糖型，分别为己糖型（50%）、N-乙酰己胺型（25%）和唾液酸化型（25%）。但是，本研究并未鉴定到卵白蛋白的N-糖基化修饰信息。由于本研究是对整个鸡蛋清的糖基化修饰进行鉴定，其中卵白蛋白的糖基化修饰程度较低，这可能导致N-糖基化位点难以被鉴定到。此外，本研究鉴定到卵白蛋白相关蛋白X上的1 个N-糖基化位点（N215），涉及153 种N-糖肽结构，主要包括岩藻糖型（40%）和唾液酸化型（30%）修饰；卵白蛋白相关蛋白Y上的4 个N-糖基化位点（N129、N249、N327、N346），涉及223 个N-糖肽结构，这些N-糖肽结构丰富多样，其中岩藻糖型占比最大（33.6%）。对于O-糖基化修饰，卵白蛋白相关蛋白X上的1 个O-糖基化位点（S336）发生修饰，涉及1 种O-糖肽结构（己糖单元组成的小分子核心结构）；而卵白蛋白相关蛋白Y有9 个O-糖基化位点（S102、T103、T104、T131、S240、S251、S359、T374和S377）发生修饰，涉及37 个O-糖肽结构，其中以己糖型修饰的糖链结构占比最高（35%）。因此，与卵白蛋白相关蛋白X相比，卵白蛋白相关蛋白Y的糖基化修饰模式更为复杂多样。

此外，本研究还鉴定出含量较少的其他鸡蛋清糖蛋白。例如，鉴定到卵巨球蛋白（A0A8V0ZKM2）上的5个N-糖基化位点（N82、N191、N527、N1315、N1347），涉及45 个N-糖肽，其中31 个N-糖肽为复杂型/杂合型；载脂蛋白M（A0A8V1AH71）含有5 个N-糖基化位点（N36、N82、N90、N97、N107），涉及214 个N-糖肽；簇蛋白（A0A8V0Y0J2）含有4 个N-糖基化位点（N154、N196、N407、N427），涉及55 个N-糖肽；核黄素结合蛋白（A0A140T8H8）含有65 个N-糖肽（N53、N164）和1 个O-糖肽（S45）；溶菌酶（P00698）含有1 个O-糖基化位点（T58）和1 个O-糖肽。

进一步对鉴定到的N-糖基化修饰和O-糖基化修饰鸡蛋清蛋白质进行统计分析（图6）。结果发现，仅发生N-糖基化修饰或O-糖基化修饰的鸡蛋清蛋白质分别为40 个和20 个，这表明大部分鸡蛋清蛋白质的糖基化修饰模式是单一的。有9 种鸡蛋清蛋白质同时发生了2 种糖基化修饰，包括卵黏蛋白、卵转铁蛋白、卵白蛋白相关蛋白X、卵白蛋白相关蛋白Y、核黄素结合蛋白、α-2-巨球蛋白样蛋白1、5号丝氨酸肽酶抑制剂（Kazal型）、7号丝氨酸肽酶抑制剂（Kazal型）和血管生成素类似物3。本研究明确了鸡蛋清蛋白质的N-/O-糖基化修饰结构信息，为进一步探究其功能活性与结构之间的内在联系提供了理论基础。

鸡蛋清糖蛋白的潜在功能分析

鸡蛋清作为一种优质的膳食蛋白质来源，蛋清蛋白质在食品领域被广泛应用。蛋清蛋白经胃肠道消化后会产生大量的蛋清糖肽。然而，蛋清糖肽在胃肠道的功能特性鲜被研究。先前的研究通过体外模拟消化和亲和层析富集获得了蛋清糖肽，并通过蛋白质组学分析研究了蛋清糖肽对小鼠巨噬细胞（RAW264.7）蛋白质表达的影响，结果发现蛋清糖肽刺激RAW264.7后导致184 个蛋白质表达显著变化，并且这些差异蛋白与核因子-κB信号通路、肿瘤坏死因子信号通路和C型凝集素受体信号通路相关。因此，蛋清蛋白质经胃肠道消化后，生成的糖肽可能会对肠道的免疫调节发挥作用。本研究结合KEGG通路富集分析探讨了含不同糖型修饰的N-/O-糖蛋白涉及的功能差异，可为蛋清糖肽结构与功能的相关性研究提供重要信息。

对于N-糖基化修饰，白细胞介素-17（IL-17）信号通路与5 种糖型修饰的蛋白质均显著相关，尤其是与岩藻糖型、低甘露糖型和唾液酸化型高度显著相关，这表明5 种糖型修饰的糖蛋白均可参与IL-17信号通路的调控（图7A）。在本研究中，卵黏蛋白、卵白蛋白相关蛋白X和卵白蛋白相关蛋白Y含有3 种糖型（低甘露糖型、岩藻糖型和唾液酸化型）的N-糖链分别占总N-糖链的40.4%（197 条）、74.5%（114 条）和64.1%（143 条），表明3 种糖蛋白（特别是卵黏蛋白）经胃肠道消化后产生的N-糖肽或许可通过参与IL-17信号通路的调控，在免疫调节中发挥重要作用。此外，铁死亡仅与唾液酸化型蛋白质显著相关。铁死亡是一种新的调控细胞死亡模式，描述为铁依赖性过氧化物诱导的细胞死亡，是由过度堆积的过氧化脂质诱导的细胞死亡。唾液酸作为一种含有C9骨架的酸性单糖，普遍存在于黏膜表面，可参与肠道免疫调节系统和病原微生物感染。本研究鉴定到卵黏蛋白、卵白蛋白相关蛋白X和卵白蛋白相关蛋白Y分别含有41、46 条和54 条唾液酸化型N-糖肽，因此，推测含唾液酸化修饰的N-糖蛋白（特别是卵白蛋白相关蛋白Y）经胃肠道消化后产生的唾液酸化N-糖肽可能通过调节铁死亡改善肠道健康。

对于O-糖基化修饰，胆固醇代谢与4 种糖型修饰的蛋白质显著相关，特别是与唾液酸化修饰的蛋白质极显著相关（图7B）。胆固醇的来源有两种：肝脏合成（80%）和肠道吸收（20%）。胆固醇稳态对于细胞和机体功能至关重要，胆固醇代谢异常可导致多种疾病，如心血管疾病、神经退行性疾病和癌症。因此，鸡蛋清蛋白质经胃肠道消化后产生的O-糖肽或许会影响胆固醇的肠道吸收。值得注意的是，本研究鉴定到卵黏蛋白、卵白蛋白相关蛋白Y、卵白蛋白和卵转铁蛋白分别含有78、11、5 条和1 条唾液酸化型O-糖链，其中卵黏蛋白含有唾液酸化型O-糖链最多，这表明卵黏蛋白经胃肠道消化后对胆固醇肠道吸收的影响最大。此外，维生素消化和吸收、低氧诱导因子（HIF）-1信号通路和肾素-血管紧张素系统与唾液酸化修饰的蛋白质显著相关，这表明含唾液酸化修饰的O-糖肽或许与肠道多种疾病密切相关。有趣的是，IL-17信号通路与岩藻糖型和N-乙酰己胺型修饰型O-糖蛋白显著相关。卵黏蛋白、卵白蛋白相关蛋白Y、卵转铁蛋白和卵白蛋白含有岩藻糖型和N-乙酰己胺型O-糖链分别占总O-糖链的31.9%（69 条）、35.1%（13 条）、66.7%（2 条）和25.0%（5 条），表明上述4 种糖蛋白（特别是卵黏蛋白）经胃肠道消化后产生的O-糖肽可能通过调控IL-17信号通路发挥免疫调节作用。此外，胃酸分泌和细胞间黏附连接与岩藻糖型修饰的蛋白质显著相关；铁死亡和矿物质吸收与N-乙酰己胺型修饰的蛋白质显著相关，这些通路均与肠道功能密切相关。综上所述，这些结果表明卵黏蛋白的O-糖链对于肠道的功能至关重要。总之，不同糖型修饰的N-/O-糖蛋白发挥的生物功能活性差异较大，因此其消化后产生的不同糖型修饰的糖肽功能不同，在今后的研究中需根据糖链结构有针对性的挖掘糖肽潜在的肠道功能特性。

结论

本研究基于液相色谱-质谱联用技术对鸡蛋清糖肽结构进行鉴定，共鉴定到1 720 个N-糖肽结构，涉及99 个N-糖基化位点和49 种N-糖蛋白；565 个O-糖肽结构，涉及90 个O-糖基化位点和29 种O-糖蛋白。N-糖基化修饰和O-糖基化修饰分别含有5 种糖型（高甘露糖型、低甘露糖型、岩藻糖型、唾液酸化型和复杂型/杂合型）和4 种糖型（己糖型、岩藻糖型、N-乙酰己胺型和唾液酸化型）。进一步分析了蛋清中主要糖蛋白（包括卵黏蛋白、卵转铁蛋白、卵白蛋白、卵白蛋白相关蛋白X和卵白蛋白相关蛋白Y）的N-/O-糖链结构信息。其中，卵黏蛋白糖肽结构丰度多样，包括490 种N-糖肽结构和216 种O-糖肽结构。KEGG通路富集分析发现，IL-17信号通路与5 种糖型修饰的N-糖蛋白和2 种糖型（岩藻糖和N-乙酰己胺修饰）修饰的O-糖蛋白显著相关；铁死亡与唾液酸化修饰的N-糖蛋白和N-乙酰己胺型修饰的O-糖蛋白显著相关；唾液酸化修饰的N-糖蛋白和O-糖蛋白分别主要涉及与炎症相关的肠道功能（IL-17信号通路和铁死亡）和与吸收代谢相关的肠道功能（胆固醇代谢和维生素消化和吸收）。研究结果全面鉴定了鸡蛋清蛋白质的糖肽结构，有助于进一步探索蛋清糖肽在肠道发挥功能特性的潜在作用机制。

作者介绍

通信作者：

王金秋，博士，副教授，硕士生导师。主要从事农产品加工与贮藏工程、禽蛋原料特性与贮藏保鲜的教学和科研。主持国家自然科学基金面上基金和青年基金各1 项、四川省自然科学基金面上项目1 项、四川省科技厅国际合作项目1 项、成都市科技局项目1 项、其他厅局级项目2 项，获成都大学高层次人次培育计划资助。以第一作者/通信作者发表高水平论文30余篇（中科院一区20余篇）,获授权发明专利1 件，参编教材2 部。