在一场音乐会中，指挥家无疑是 “灵魂人物”，他们可以控制整首曲子呈现的速度及演出的效果，同时还有激发乐团成员最佳潜能的责任。启动子在基因转录的过程中也是担任类似的角色，它能够控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。

合成生物学的发展在很大程度上依赖于启动子的发现和表征。该学科通过工程化的思路，对代谢通路进行改造和设计来生产目标产物。代谢途径的构建通常涉及多个基因的表达，其表达水平跨越几个数量级，简而言之，需要按照目标需求 “该多的多，该少的少”，以确保所需产物的产量最高。想要实现基因的精细调控，不同基因的表达需要不同的启动子来介导，启动子的强度当然也是不同的。

然而，内源性启动子通常难以满足代谢通量的合理设计和优化要求，存在 “动态范围很差（指启动子调控的强弱梯度）” 和 “调控通常与内源性调控不正交” 等问题。例如，P GAL1 （半乳糖激酶基因启动子）在代谢途径的构建中经常被反复用于表达不同的酶，然而利用过多的半乳糖诱导型启动子可能会由于转录激活子 Gal4p 的耗竭而干扰半乳糖的代谢。

想要解决上述问题，除了开发外源合成启动子，还需要挖掘通过上游激活序列 (UAS) 调控组成型启动子强度的方法。

近日，在 ACS Synthetic Biology 期刊上发表了一项新研究，论文题为 “Programmable Synthetic Upstream Activating Sequence Library for Fine-Tuning Gene Expression Levels in Saccharomyces cerevisiae”。该研究设计、构建和表征了一个 UAS 库，有助于精确调整酿酒酵母生产目标蛋白的转录水平。

此次，生辉 SynBio 邀请到论文的通讯作者，江南大学的邓禹教授来与我们分享他的最新研究成果。

图丨邓禹（来源：受访者）

邓禹本科和硕士均就读于江南大学，研究生时师从陈坚院士，在发酵工程方面积淀深厚。硕士毕业后，他选择前往美国弗吉尼亚联邦大学继续深造，攻读化学与生命科学工程专业博士学位，并于 2011 年顺利毕业。之后，他先在美国达特茅斯学院开展 3 年的博士后研究，又在美国堪萨斯州立大学做了 1 年助理教授。2015 年初，邓禹回到母校江南大学任职，至今一直从事科学研究和教学工作。其主要研究方向有合成生物学、代谢工程和发酵工程。

酿酒酵母中基因表达水平的调节

酿酒酵母作为一种真核模式生物，遗传背景清晰、生长迅速、易培养且安全。因此，酵母细胞被广泛用作合成生物学中的 “细胞工厂”，目前已经被开发生产重组蛋白、生物燃料、天然和非天然产品、大宗化学品和精细化学品等产物。启动子则是调控酿酒酵母中基因表达水平的重要元件。

经典案例之一是，2005 年麻省理工学院的科学家们，在工程化的产番茄红素菌株的优化过程中，对酿酒酵母的 TEF1 启动子改造，建立突变启动子库，得到一系列强度不同的突变启动子，实现基因的精确调控。

在酿酒酵母中，内源启动子可分为两种类型，诱导型启动子和组成型启动子。

诱导型启动子是强启动子，在特定刺激存在或不存在时，能够引发基因转录水平的显著变化。在酿酒酵母中，半乳糖诱导型启动子是强启动子的代表，它的不足之处是，只有在碳源为半乳糖时才能被激活，与葡萄糖相比，当碳源为半乳糖时，菌株的生长可能受到限制；而且，诱导型启动子的强度无法进行梯度调控；还有一个是成本问题。

组成型启动子则能够保持相对稳定的转录水平，几乎不受细胞内或细胞外刺激的影响。但与诱导型启动子相比，它的强度要弱得多。

邓禹团队选择组成型启动子为研究对象，设法保持转录水平稳定的同时，让其拥有不逊于诱导型启动子的调控强度。

酿酒酵母启动子的结构包括核心启动子区域、上游激活序列 (UAS)、上游阻遏序列 (URS) 和对核小体不利的序列（导致核小体耗尽）。其中，UAS 是启动子中增强基因表达的关键区域，相对于核心启动子区域的调控，操作也更为简便。

图丨酿酒酵母中的启动子结构（来源：论文）

“目前，在酿酒酵母细胞中，大部分的研究还局限于，通过把不同启动子的 UAS 进行组合来改变启动子的强度，这无形中增加了酵母启动子的长度，导致后续的分子操作不方便。” 邓禹告诉生辉 SynBio。

因此，邓禹团队产生了新的想法：通过改变 UAS 的序列来改变启动子的强度。

上游激活序列库的构建与表征

据邓禹介绍，在研究过程中，他们首先确定了启动强度最高的组成型表达启动子 ——TDH3 基因的启动子，并对其进行 UAS 突变，然后通过易错 PCR 创建了突变体库，该突变库的动态调控范围为 37 倍，其中强度最强的突变体 UAS 的强度是野生型 UASTDH3的 12 倍。

他们通过对突变体库的分析发现，UASTDH3的 15 个强度增强位点及其对应的碱基对 UAS 的强度影响最大， 这就为下一步构建 UAS 合成库提供了设计策略。通过 15 个增强点的碱基排列组合构建了 32,768 个 UAS 突变体合成库。

“为了确定该库的动态范围，需要建立 UAS 碱基序列与 UAS 强度之间的关系”，他说，“这也正是这项研究工作最大的难点。”

“因为 UAS TDH3 序列有近 300 bp，不同的碱基组合能够获得上亿个 DNA 分子，怎么找到不同碱基组合与 UAS 强度之间的关系，或者通过某个中间表征方法把这种联系建立起来是非常困难的，工作量也非常大。”

图丨 基于 UAS 库预测启动子强度的策略示意图（来源：论文）

为了解决这一难题，邓禹及团队建立了一个 UAS 碱基序列与 UAS 强度的预测模型。

邓禹进一步解释说，不同的碱基组合可以构成不同的 DNA 分子，每个 DNA 分子的结构也是不一样的。在我们的分析中使用了三种不同的 DNA 结构特征：DNA 稳定性、弯曲性和曲率，因为它们在生物学上是相关的，而且每个特征的信息含量是不同的。

通过计算每个 DNA 分子的稳定性、弯曲性和曲率，来表征他们的结构特征并与他们对应的 UAS TDH3 突变体表达强度进行比较，最后发现 15 个增强点的碱基排列和 UAS TDH3 的关系是与 DNA 曲率密切相关的。

“通过进一步的实验验证，我们建立了 UAS 强度的自然对数 (ln [lacZ activity]) 与 DNA 曲率之间的关系。这就使得 DNA 强度与 DNA 碱基序列之间的关系被简单化，便于后续的预测和设计，预测准确率达到 80% 左右。利用该模型，可以实现对靶基因的精准调控。” 邓禹说道。

在实际应用中实现倍量增产

近些年，无论是在论文数量还是技术方法等方面，合成生物学都取得了举世瞩目的成绩。酿酒酵母合成生物学的研究相对落后于大肠杆菌合成生物学的研究，一方面是因为酿酒酵母的表达体系和细胞结构较为复杂，另一方面是对于酿酒酵母表达元件的研究较少。

该研究对于 UAS 库构建和预测的水平，是之前研究中未曾实现的。与此同时，也带来了相当高的商业价值。

“一方面是能够节约发酵成本，例如诱导型启动子需要使用昂贵的诱导剂，无形中就增加了生产成本；另一方面，突变体文库是一个通用的技术平台，理论上可以用于调控任何一个酿酒酵母基因的表达水平。”

实际上，邓禹已经把这项成果应用到了 “利用酿酒酵母合成丙二酸和葡萄糖二酸” 的合成研究中。

邓禹言语间透露着兴奋，“我们一直从事利用酿酒酵母合成葡萄糖二酸的研究工作，早在 2018 年时，团队已经实现了葡萄糖二酸的破纪录生产，当时的产量是 6 g/L。如今，通过该突变体文库的应用，在 2018 年的基础上，我们又将葡萄糖二酸的产量提高了两倍以上，达到 15 g/L，在业内也是最高水平。这主要是通过调控丙二酸和葡萄糖二酸生物合成途径中关键酶的表达来实现的。”

他还透露，目前，团队已经实现了己二酸和丙二酸的技术转让和产业化，葡萄糖二酸、乙醇酸和二元胺的相关成果正在考虑进行产业转化应用。

在采访最后，邓禹表示，关于上游激活序列库的研究，后续还有很多工作要做，主要是进一步对模型进行优化，提高模型的准确性，比如可以与 DNA 更多的特性结合，采用更加智能的机器学习建立模型，更加准确和全面地预测启动子强度；另一方面，进一步扩大这个 UAS 突变体文库的调解范围也非常重要，形成更加完整的强度梯度，以便更精准地对目的基因的表达进行调控。

参考资料：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32781665/

https://cjb.ijournals.cn/html/cjbcn/2021/3/gc21030874.htm

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1200280/

https://mp.weixin.qq.com/s/UgDhXXCW0mkXTYyuXMTdUA

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