J VIROL|哈尔滨医科大学赵文然/钟照华教授团队发现B组柯萨奇病毒3D聚合酶的拟素化修饰可促进病毒复制|rna|哈尔滨医科大学|国产九价疫苗|基因改造病毒|拟素化|柯萨奇病毒|细胞|聚合酶|蛋白|赵文然|钟照华

B组柯萨奇病毒（ Coxsackievirus group B，CVB ）是一类无包膜的单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科肠道病毒属。目前已知的CVB有六种血清型（CVB1~6），其引发的疾病谱系从普通感冒到病毒性心肌炎、胰腺炎及脑膜炎不等。其中，CVB1、CVB3和CVB5具有天然嗜心脏特性，而CVB3 已被证实是心肌炎、扩张型心肌病甚至心力衰竭的主要致病病原体，目前仍缺乏特异有效的抗病毒药物。

近日，哈尔滨医科大学赵文然教授联合钟照华教授团队在Journal of Virology上发表了题为“The neddylation of the RNA-dependent RNA polymerase 3D of Coxsackievirus B3 promotes viral replication”的研究论文，系统的揭示了拟素化（ neddylation ）修饰在促进CVB3复制过程中的关键作用和分子机制。

作者首先通过质谱分析技术对CVB3感染细胞的蛋白表达谱进行解析，发现病毒感染后NEDD8的表达显著上调。随后，为探究单个病毒蛋白是否具有影响拟素化修饰的能力，作者对表达病毒成熟蛋白或前体蛋白细胞中NEDD8的表达情况进行了检测，结果显示所有病毒蛋白均未能改变NEDD8表达水平，提示NEDD8上调及拟素化修饰增强是病毒复制所导致的。作者通过CVB5感染实验证实，拟素化修饰上调现象在不同CVB血清型中具有普遍性，这暗示了拟素化修饰上调在CVB感染过程中具有重要意义。由于前期研究发现3D聚合酶存在泛素化修饰，而泛素与NEDD8蛋白具有高度同源性，作者因此推测3D可能发生拟素化修饰。为验证该假设，作者进行了一系列实验验证，发现在发生翻译后拟素化修饰的是3D而非3C或其前体蛋白。时间梯度实验显示，随着病毒感染进程，高分子量的3D会发生持续性累积。此外，为了明确3D是否受NEDD8修饰，作者分别对过表达3D的细胞进行了变性免疫共沉淀实验。结果显示，外源表达的3D确实发生拟素化修饰。随后，作者在病毒感染自然进程中也确认了3D的拟素化修饰现象。以上结果充分的证明了CVB3的3D蛋白发生拟素化修饰。

接下来，作者发现敲低NEDD8导致病毒RNA水平显著下降，表明拟素化修饰能有效促进CVB3复制，点突变实验进一步显示3D的拟素化修饰特异性发生于第261位和第457位赖氨酸残基。随后，作者通过放线菌酮追踪实验检测野生型3D及其K261、K457及K261/457位点突变体的降解速率，结果显示过表达NEDD8可显著抑制3D降解，这表明拟素化修饰能有效增强3D稳定性。相反，在K261、K457或双位点突变体（K261/457）中，3D降解速率均显著加快，这充分证明了拟素化修饰有助于提高3D的稳定性。

最后，作者对CVB3如何利用拟素化修饰来增强3D的稳定性进行了深入探究。作者通过免疫共沉淀实验对与3D相互作用的蛋白进行检测。由于已知的NEDD8 E3连接酶均属于泛素E3连接酶家族，因此作者特别关注泛素E3连接酶。有趣的是，质谱检测的结果显示TRIM4与3D蛋白存在相互作用。在后续实验中，作者进一步证实了TRIM4不仅能与3D相互作用，还能以剂量依赖方式增强3D的拟素化修饰。此外，敲低TRIM4几乎完全阻断了3D的拟素化修饰，而过表达TRIM4有效的促进病毒蛋白3D和VP1蛋白的表达水平。更明显的是，在过表达TRIM4的细胞中还观察到CVB3的复制呈显著提升。以上数据共同证明，TRIM4通过介导3D的拟素化修饰来促进CVB3复制。