Nat Cell Biol | G3BP应激颗粒蛋白加强ISR翻译抑制程序|mrna|内源性|细胞|翻译|蛋白

撰文|一只鱼

当细胞受到氧化应激、高温和有害化学物质等压力时，会启动整合应激反应（ ISR ），导致整体翻译水平下降，同时允许应激响应性mRNA进行选择性翻译，从而帮助细胞应对压力。在这种剧烈的翻译状态转变过程中，细胞质中会通过液-液相分离形成应激颗粒，这些颗粒是由RNA结合蛋白、mRNA和翻译机器组成的无膜结构。应激颗粒包含多样化的蛋白质组，其形成必须依赖RNA结合蛋白G3BP1与G3BP2（统称为 G3BPs ）。但 G3BPs蛋白与应激颗粒在应激期间对翻译的整体影响仍不清楚。

近日，来自美国Whitehead生物医学研究所的 David P. Bartel 研究团队在 Nature Cell Biology 上发表题为 The G3BP stress-granule proteins reinforce the integrated stress response translation programme 的文章，发现应激颗粒富集着对应激诱导的翻译关闭具有抵抗性的mRNA ，准确招募这些抗应激mRNA需要应激背景。光遗传学工具与加标标准化核糖体图谱技术的结合分析表明，G3BPs和应激颗粒充分必要帮助优先翻译其富集的mRNA，并同时抑制细胞质中的翻译活动。

为了用核糖体图谱测量应激导致的翻译效率的绝对变化，研究人员开发了一种核糖体图谱加标法（ ribo-spike ），用确定量的兔网织红细胞裂解液翻译正交萤火虫荧光素酶mRNA，随后将其加标至每个样本中。为了敲除G3BPs，他们用RFP和植物激素诱导降解标签（AID）标记内源性G3BP1和G3BP2基因，从而在添加吲哚-3-乙酸（IAA）后实现蛋白的快速高效降解。利用这些降解系细胞，他们采用核糖体图谱结合ribo-spike技术，比较了细胞翻译状态，发现相较于G3BPs缺失细胞，正常细胞在 ISR 期间呈现稍强的全局翻译抑制（1.4倍），这与以往研究中G3BPs对ISR引起的全局翻译抑制基本非必需的观点一致，但也说明 G3BPs确实对ISR期间发生的强烈翻译抑制有所贡献，虽然作用有限。他们比较了G3BPs存在与ISR激活各自引发的翻译变化，发现两者呈明确正相关，意味着 G3BPs倾向于在翻译水平上正向调控ISR上调的mRNA，同时负向调控ISR下调的mRNA，从而强化ISR翻译程序。

他们进一步分析ISR调控与应激颗粒富集度的关系，发现应激期间翻译得以维持或增强的mRNA更倾向富集于应激颗粒，而高敏感型mRNA则呈耗竭趋势，并且 G3BPs的存在倾向于增强应激颗粒富集型mRNA的翻译效率，而对应激颗粒耗竭型mRNA则呈现翻译抑制趋势，提示那些受ISR翻译程序最强上调的转录本通过定位于应激颗粒进而获得G3BPs介导的进一步翻译增强。接下来他们想知道应激颗粒的形成是否足以在无外源应激时驱动这些翻译变化，于是他们尝试在非应激条件下诱导异位应激颗粒，通过改进CRY2光遗传学系统。将G3BP1的N端NTF2L二聚化结构域替换为蓝光依赖的隐花色素2光裂合酶同源区寡聚化结构域（CRY2），并加上 GFP标签（GFP::CRY2::G3BPΔN），即使在无蓝光条件下，多西环素诱导表达该构建体仍能导致约20%细胞形成异位凝聚体，当这些细胞暴露于蓝光时，应激颗粒形成显著增强， 3小时内约80%细胞出现应激颗粒，称为光控颗粒（ OGs ）。他们发现 OGs诱导细胞呈现适度的全局翻译效率下降，但进一步分析显示 OGs 翻译变化既不与ISR翻译程序相关，也不与应激细胞中G3BP依赖性翻译变化相关，应激颗粒富集型mRNA的翻译表现也并不优于其他 mRNA。因此 OGs虽能驱动适度的全局翻译抑制，但不足以特异地启动ISR 。

由于应激条件下形成的应激颗粒与无应激条件下形成的光控颗粒中的 mRNA 组分可能不同，他们将多西环素诱导的GFP::CRY2::G3BPΔN构建体整合到表达内源性AID::RFP::G3BPs与多西环素诱导型OsTIR1（负责AID降解的E3连接酶）的细胞中。经过多西环素和IAA处理，这些细胞降解了内源性G3BPs并以GFP::CRY2::G3BPΔN替代，使其即使在应激条件下，若无蓝光照射也无法形成应激颗粒。但当这些细胞同时经历应激和蓝光照射时能迅速形成颗粒，这种应激条件下形成的光控颗粒称为应激光控颗粒（ SOGs ）。随后他们对光控颗粒与应激光控颗粒相关的转录本进行纯化和测序，发现无应激条件下形成的OGs 与对照应激颗粒相关性较低，而SOGs 富集的转录本与对照应激颗粒高度相似，这说明应激颗粒与 OGs 转录组的差异源于细胞应激状态，因此建立应激颗粒转录组不仅需要G3BPs构建的相互作用网络，还依赖于细胞应激期间形成的RNA结合状况。最后他们将报告基因锚定至应激颗粒来检测其翻译是否受影响，选择与内源性G3BP1融合的MCP作为应激颗粒锚定蛋白，将报告基因稳定整合至内源性GFP::G3BP1或MCP::GFP::G3BP1的细胞中 , 报告基因编码与大肠杆菌二氢叶酸还原酶（ecDHFR）不稳定结构域融合的纳米荧光素酶（nLuc），该结构域可导致其融合蛋白快速周转，从而确保检测到近期翻译的nLuc活性。报告基因mRNA的3′-UTR包含24个噬菌体MS2发夹结构阵列，可结合MCP，从而将报告基因锚定至应激颗粒，通过分析验证了定位至应激颗粒会使mRNA在应激期间获得优先翻译权。

总的来说，这项研究揭示了 G3BPs和应激颗粒通过优先翻译其内部富集的mRNA来强化应激翻译程序。

https://doi.org/10.1038/s41556-025-01834-3

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