Nat Chem Biol | 艾华松/刘磊/潘漫合作揭示组蛋白糖基化修饰别构激活泛素化酶复合物对H2BK120泛素化的机制|介导|刘磊|复合物|活性|潘漫|素化|艾华松|蛋白

蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基上的β-N-乙酰葡糖胺（ O -GlcNAc）修饰广泛参与多种关键细胞过程的调控，包括表观遗传调节、蛋白质稳态维持、能量代谢以及激素信号传导；其异常与糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病及肿瘤等多种慢性疾病的发生发展密切相关【1】。 O -GlcNAc修饰可通过影响蛋白构象与稳定性、调节酶活性、改变亚细胞定位以及介导蛋白-蛋白相互作用等方式发挥功能。近年来， O -GlcNAc修饰被纳入 “ 组蛋白密码 ” 理论框架，并被发现可与泛素化、磷酸化等其他组蛋白修饰发生功能性协同或串扰，从而共同调控基因转录及DNA损伤修复过程【2】。作为早期2011年被发现具有明确生理功能的组蛋白 O -GlcNAc修饰，组蛋白H2B第112位丝氨酸残基的 O -GlcNAc修饰（H2BS112GlcNAc）在转录激活和DNA损伤修复中发挥重要生理功能【3】。

H2BS112GlcNAc可促进RNF20/RNF40-RAD6A泛素化酶复合物介导的组蛋白H2B第120位赖氨酸残基的泛素化修饰（H2BK120Ub），从而增强下游转录激活信号【4】。尽管早期研究推测H2BS112GlcNAc可能通过促进RNF20/RNF40-RAD6A泛素化酶复合物的招募来发挥功能【4】，但在E3泛素连接酶RNF20/RNF40及其对应的E2泛素偶联酶RAD6A中均未发现已知的糖结合结构域。 H2BS112GlcNAc促进H2BK120Ub的分子基础仍有待阐明。

2026年1月6日，上海交通大学艾华松、潘漫和清华大学刘磊在 Nature Chemical Biology 发表了文章 Allosteric Activation of RNF20/RNF40–RAD6A-Mediated H2BK120 Monoubiquitylation by H2BS112 GlcNAcylation ，通过蛋白质化学合成、结构生物学、糖基化结构替换及定量生化分析等多种手段，揭示了核小体上糖基化修饰H2BS112GlcNAc在不改变RNF20/RNF40-RAD6A泛素化酶复合物与核小体底物之间结合力的情况下，改变酶活中心关键残基构象等微环境，变构激活E2酶RAD6A，促进组蛋白H2B第120位赖氨酸残基进攻RAD6A~Ub硫酯中间体，从而提高H2BK120泛素化效率。

作者们首先通过微波多肽固相合成技术制备了组蛋白H2B两个片段（1-57，58-125），并通过团队发展的多肽酰肼法【5】进行片段连接，随后脱硫得到组蛋白H2BS112GlcNAc。接着，作者们使用H2BS112GlcNAc蛋白组装成的核小体，进行了体外泛素化反应定量重构。结果表明， RNF20/RNF40-RAD6A泛素化酶复合物在 H2BS112GlcNAc修饰核小体上催化生成H2BK120Ub的酶活效率显著增强。

作者接下来研究催化激活的机制。为获取 RNF20/RNF40-RAD6A泛素化酶复合物结合 H2BS112GlcNAc修饰核小体的复合物，作者应用课题组此前发展的分裂内含肽共价复合物捕获 (split-intein-based covalent complex, SICC) 技术，设计并合成了同时带有H2BS112GlcNAc修饰和内含肽融合标签的核小体底物探针SN1 。利用该核小体探针，作者捕获了RNF20/RNF40-RAD6A泛素化酶复合物结合 H2BS112GlcNAc修饰核小体的复合物，并通过冷冻电镜解析了该复合物分辨率为3.48埃的结构。

该结构中，作者们直接观察到H2BS112GlcNAc修饰与RAD6A互作，而不与 RNF20/RNF40接触，这个现象修正了前人认为O-GlcNAc修饰与RNF20/RNF40 E3酶互作的假说。将该结构与作者课题组之前报道的RNF20/RNF40-RAD6A结合 H2BS112GlcNAc修饰核小体的结构(PDB 8IEJ)【6】进行比较可发现：1) RNF20/RNF40-RAD6A结合核小体的整体构象几乎不发生改变(RMSD = 0.219 埃)；2) RAD6A与H2BS112GlcNAc糖环接触的Q93区域发生显著变构；Q93的主链α碳原子朝向核小体位移了1.6埃，表明H2BS112GlcNAc修饰改变E2酶RAD6A催化中心附近的微环境。

作者们接着测量了H2BS112GlcNAc存在与否对 RNF20/RNF40-RAD6A泛素化酶复合物的酶促反应动力学参数的影响。结果表明， H2BS112GlcNAc不改变RAD6A的米氏常数 K m 值，而是显著提高了RAD6A的催化常数 k cat 值。这与结构观测一同表明H2BS112GlcNAc别构激活了RAD6A。通过精细的单循环pH滴定泛素化实验，作者们进一步测量了H2BS112GlcNAc修饰对核小体底物上H2B K120赖氨酸侧链ε-氨基的pK值。结果表明，当核小体底物上存在H2BS112GlcNAc修饰时，H2B K120侧链ε-氨基的pK值会从未修饰核小体情况下的7.33降低到7.07，表明 H2BS112GlcNAc修饰增强了H2B K120侧链ε-氨基的亲核性增强，即进攻RAD6A~Ub硫酯中间体生成H2BK120Ub的能力增强。

H2BS112GlcNAc直接与RAD6A Q93残基的主链羰基互作。受限于难以对蛋白质氨基酸主链原子进行突变，作者们通过蛋白质化学合成，获取了β-GlcNAc的五种天然糖基化变体修饰的核小体用于结构–活性关系研究。这些变体包括：1) 缺失乙酰基的β-D-氨基葡萄糖（β-GlcN）；2) 其C2位乙酰氨基被羟基取代的β-D-葡萄糖（β-Glc）；3) C4位羟基由平伏键构型转变为直立键构型的β-N-乙酰半乳糖胺（β-GalNAc）；4) 在C1位具有不同 O -糖苷键构型的α-GlcNAc；5) 同时缺失C2位乙酰氨基和C5位羟甲基的β-D-木糖（β-Xyl）。作者们使用化学合成的六种糖基化修饰核小体底物进行了详细的定量生化研究。结果表明， β-糖苷键构型和C2位的乙酰氨基是H2BS112GlcNAc修饰与RAD6A进行互作，并产生别构激活效应的关键因素。

综上所述，本研究聚焦组蛋白 PTM 串扰的核心机制，通过蛋白质化学合成、结构生物学、糖基化结构替换及定量生化分析等多种手段，揭示了 H2BS112GlcNAc 修饰通过变构激活 E2 酶 RAD6A，增强 RNF20/RNF40–RAD6A 介导的 H2BK120Ub 修饰。该发现填补了 O -GlcNAc参与组蛋白 PTM 串扰的结构机制空白，首次阐明底物糖基化直接激活酶活性的新模式，为理解营养代谢信号与表观遗传调控的关联提供了全新视角（图1）。

图 1 ：组蛋白糖基化修饰H2BS112GlcNAc促进泛素化修饰H2BK120Ub的机制模式图

上海交通大学药学院艾华松副教授、清华大学化学系刘磊教授和上海交通大学转化医学研究院潘漫副教授为本文的共同通讯作者。清华大学化学系博士后邓智亨、生命学院2020级博士生陶仕贤、化学系博士后杜运祥、山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院（药物研究所）李玉磊副教授为本文共同第一作者。

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艾华松副教授课题组主要聚焦染色质泛素化的化学构建与调控机制的化学生物学研究。 1）发展了系列化学辅基介导偶联的泛素化组蛋白合成策略，突破染色质泛素化精准构建的核心技术难题，实现了邻近位点双泛素化、泛素链修饰、泛素-磷酸双修饰等复杂泛素化修饰染色质的高效化学制备；2）开发了多种基于酶学反应机理的化学捕获探针，系统搭建染色质泛素化与去泛素化机制研究的方法学平台，阐明了泛素E3酶/DUB的底物识别与活性选择性机制；3）依托精准构建的染色质体系，揭示了滑膜肉瘤等重要疾病相关的染色质泛素化的新型调控机制。（课题组网站： https://www.x-mol.com/groups/ai_huasong ）

刘磊教授课题组研究蛋白质化学合成。发现了蛋白酰肼连接反应，发明了已被国际学术界与工业界普遍采用的蛋白质化学合成新方法即蛋白酰肼法，完成超过200种具有公认重要功能的蛋白质的高效合成，开启了国际蛋白质化学合成跨入超越500氨基酸的新时代，运用蛋白酰肼法人工合成蛋白质，突破了生物方法制备蛋白的局限，为生物医学及药物发现研究提供了关键技术，解答了诸如泛素E3连接酶连续性催化底物蛋白泛素化及链延伸的分子机制等若干公认具有挑战性的生物化学难题，完成了多个潜在蛋白靶点的创新药物概念确认和先导分子发现。（课题组网站： http://www.liulab-tsinghua.com/ ）

潘漫副教授课题组致力于通过化学生物学交叉技术，包括蛋白合成化学、蛋白探针组学、冷冻电镜等技术，发掘新型蛋白稳态调控过程，解析蛋白稳态调控过程的关键酶促分子机制，并期望推动新型靶向蛋白稳态类药物研发。具体展开方向包括 1）开发设计新型泛素修饰蛋白探针，运用探针工具解析泛素化修饰调控蛋白稳态的关键酶促分子机制，并基于机制理性设计新型靶向蛋白稳态的方法策略；2）发展精准泛素修饰蛋白获取方法，用于新型蛋白稳态调控过程发掘，为蛋白稳态调控药物分子开发提供新赛道。（课题组网站： https://www.x-mol.com/groups/panlab ）

https://www.nature.com/articles/s41589-025-02109-6

制版人：十一

参考文献

1. Yang, X. Y. & Qian, K. V. Protein O-GlcNAcylation: emerging mechanisms and functions.Nat. Rev. Mol. Cell Biol.18, 452–465 (2017).

2. Hanover, J. A., Krause, M. W. & Love, D. C. Bittersweet memories: linking metabolism to epigenetics through O-GlcNAcylation.Nat. Rev. Mol. Cell Biol.13, 312–321 (2012).

3. Chen, Q., Chen, Y., Bian, C., Fujiki, R. & Yu, X. TET2 promotes histone O-GlcNAcylation during gene transcription.Nature493, 561–564 (2013).

4. Fujiki, R. et al. GlcNAcylation of histone H2B facilitates its monoubiquitination.Nature480, 557–560 (2011).

5. Fang, G. M. et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.Angew. Chem. Int. Ed.50, 7645–7649 (2011).

6. Deng, Z. et al. Mechanistic insights into nucleosomal H2B monoubiquitylation mediated by yeast Bre1–Rad6 and its human homolog RNF20/RNF40-hRAD6A.Mol. Cell83, 3080–3094 (2023).

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（*排名不分先后）