FSHW | 比较代谢组学揭示了盐胁迫枯草芽孢杆菌JZXJ-7对组胺的生物降解机制|代谢物|比较代谢组学|甘露|组胺|细菌|芽孢杆菌

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Introduction

水生发酵产品是中国沿海和东南亚地区一系列消费群体普遍食用的一种食品调味料。在用盐自然发酵的过程中，脂肪和蛋白质被食品中的微生物降解为低分子量代谢物，以提供独特的风味并改善营养特性。然而，蛋白质是水产品中的主要营养物质，但被降解形成游离氨基酸，然后被假单胞菌、葡萄球菌、胃酸杆菌和肠球菌等微生物脱羧，形成生物胺。因此，水生发酵产品中可存在高浓度的组胺、腐胺和尸胺。过量摄入这些会导致中毒症状，包括头痛、呕吐、腹泻，甚至死亡。因此，发酵水产品中生物胺的形成对水产品安全构成威胁。组胺是一种低分子量有机碱性化合物，具有高生物活性，不易降解。组胺浓度< 50 mg/kg，这是美国食品药品监督管理局（FDA）设定的标准，但在虾酱中检测到的浓度更高、鱼露和海鲜产品在发酵过程中。

目前，从发酵水产品中筛选出的细菌作为发酵剂可以有效控制发酵过程中的生物胺。枯草芽孢杆菌是一种多功能的革兰氏阳性菌，能够适应多种应激条件，如高温、高渗和血酸剥夺。这种极端条件会激活细胞过程以确保生存和生长，并增强降解有害物质的能力。近年来，枯草芽孢杆菌经常被用作模型菌株，以降解其他细菌并代谢氧氟沙星等外源性物质、纤维素和玉米赤霉烯酮。此外，枯草芽孢杆菌可以通过激活胺氧化酶基因的表达来促进生物胺代谢。中国农业和安全部已获得欧洲食品安全局（EFSA）和FDA的认证，可以在食品工业中使用枯草芽孢杆菌。细菌素的产生和活性酶（蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶）可以提高枯草芽孢杆菌在食品加工中的应用和食品发酵。

在之前的研究中，从虾酱中分离了枯草芽孢杆菌JZXJ-7能够在盐胁迫下降解组胺。然而，机制尚不清楚。在枯草芽孢杆菌JZXJ-7中的许多代谢过程可能参与包括加速生长、对活性氧（ROS）积累的抗氧化反应、K+的积累和通过位于膜上的Na+/K+-ATP酶调节的泵挤出Na+。基于超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）的代谢组学技术已被用于发现显著的代谢物变化并揭示潜在的代谢途径。本研究调查了枯草芽孢杆菌JZXJ-7经受盐胁迫组胺降解、细菌生长、抗氧化过程和Na+/K+-ATP酶反应。目的是确定代谢产物可以揭示枯草芽孢杆菌JZXJ-7还原胺经受盐胁迫的机制，并为未来开发“绿色”高效除胺发酵剂提供研究数据和理论参考。

Results and Discussion

盐胁迫枯草芽孢杆菌在组胺降解过程中的生长曲线

枯草芽孢杆菌的动态生长曲线图以指示在组胺存在下NaCl对细胞分裂的影响。在对照组中，枯草芽孢杆菌JZXJ-7达到对数生长期峰值时间为28 h，而170和340 mmol/L NaCl处理组为8 h。两个NaCl组的生长速度均低于对照组。基于培养液吸光度的增加，在> 28 h时快速生长。> 32 h，340 mmol/L NaCl组的枯草芽孢杆菌JZXJ-7生长显著升高（图1A）。由于枯草芽孢杆菌是从盐度为15%的发酵虾酱中分离出来的，因此在170-340 mmol/L（1%～2%）的浓度下，对细菌的压力最小，导致生长和新陈代谢激活。盐胁迫延长了枯草芽孢杆菌JZXJ-7进入对数期的时间，减少了转录和翻译，提供了足够的适应时间。在适应期结束时，枯草芽孢杆菌生长较好，表明盐胁迫对激活代谢能力有积极作用。

图1 （A）细菌生长曲线，（B）组胺降解率，（C）细菌总数；抗氧化酶（D）CAT，（E）SOD，（F）GST，（G）Na+/K+-ATPase活性

组胺降解

在盐胁迫下培养48 h的枯草芽孢杆菌JZXJ-7的组胺的降解速率如图1B所示。用170和340 mmol/L NaCl培养的枯草芽孢杆菌JZXJ-7对组胺的降解率分别为64.85%和79.87%，显著高于对照组的46.87%（P＜0.05）。这表明发酵食品中的枯草芽孢杆菌JZXJ-7具有很强的组胺降解能力。培养后，枯草芽孢杆菌JZXJ-7的总细菌计数在170和340 mmol/L NaCl组分别为4.04×107和4.23×107 CFU/mL（P＜0.05）与对照组中的2.95×10 7 CFU/mL相比（图1C）。这些结果证实了盐添加可有效改善组胺降解。B. cereus，B. polymyxa，B. lichemiformis和B. amyloliquefaciens从咸鱼产品中分离的解淀粉芽孢杆菌也显示出更强的降解组胺、尸胺和腐胺的能力。此外，盐胁迫可能会激活交叉保护，从而支持这些细菌的代谢调节，例如上调胺氧化酶基因和增加外排泵表达以有效地外排多种类型的有毒物质。

抗氧化酶活性

抗氧化酶反应是评估细菌（如芽孢杆菌）在暴露于压力源（包括暴露于环境压力）时保护细胞免受氧化损伤的能力的重要指标。CAT是一种关键的抗氧化酶，可分解有毒的H2O2在细菌代谢或氧化分解成分子氧和水的过程中产生。在盐胁迫下组胺降解过程中，170和340 mmol/L NaCl组的枯草芽孢杆菌JZXJ-7 CAT酶活性分别显著升高至7.36（P＜0.05）和11.27 U/mL（P＜0.01）（图1D），表明通过催化分解来抵御氧化应激，减少细胞内和内源性H2O2的过度积累。

GST催化暴露于杀虫剂、高盐、极端温度和重金属的生物体中谷胱甘肽偶联的初始步骤。GST还可以去除细胞内ROS。在本研究中，GST活性显著增加在枯草芽孢杆菌JZXJ-7暴露于170和340 mmol/L NaCl组，值分别为85.36（P＜0.05）和123.58 U/mL（P＜0.01）（图1E），表明盐胁迫下抗氧化活性升高。同样，枯草芽孢杆菌JZXJ-7的SOD活性在两个NaCl组中也上调至1.58（P＜0.05）和3.19 U/mL（P＜0.01）（图1F）。SOD酶清除自由基和ROS。作为一种耐盐发酵细菌，即使是轻微的盐胁迫也可以激活枯草芽孢杆菌的抗氧化系统，提高关键酶活性，从而增强ROS和H2O2的分解。

Na+/K+-ATPase活性

细菌中的Na+/K+-ATP酶通过调节离子穿过细胞膜的通透性来维持渗透压的稳定性。枯草芽孢杆菌JZXJ-7 Na+/K+-ATP酶活性为3.68 U/mg（图1G）。暴露于170和340 mmol/L NaCl后，Na+/K+-ATP酶活性分别显著提高至6.28（P＜0.05）和11.63 U/mg（P＜0.01）以调节渗透压。

枯草芽孢杆菌在组胺降解过程中的代谢组学

代谢物组成及主成分分析

通过UPLC-MS测定枯草芽孢杆菌JZXJ-7的细胞内代谢物，以评价盐胁迫下组胺降解机制。PCA揭示了对照组和NaCl处理组之间的代谢物差异（图2A）。PC1、PC2和PC3的变化分别为34.88%、25.57%和10.42%。代谢指纹图谱的热图也揭示了两组之间的代谢物差异。然而，170 mmol/L NaCl组中样品S3的代谢物与340 mmol/L NaCl组的样品S1聚集，表明代谢相似性（图2B）。共鉴定出2863种代谢物。根据VIP≥1、FC≥2和FC≤0.5的条件比较实验组之间的DMs。与对照组相比，170和340mmol/LNaCl组的DMs数量分别为1035和1020个。两个NaCl处理组之间的DMs数量为1054个，3组之间的常见DMs为142个（图2C）。与对照组相比，NaCl组菌中枯草芽孢杆菌JZXJ-7在组胺降解过程中的DMs多为氨基酸及其代谢物（33.39%）＞苯和取代衍生物（12.05%）＞杂环化合物（10.62%）＞有机酸及其衍生物（9.75%）＞醛、酮和酯（5.59%）＞核苷酸及其代谢物（4.58%）（图2D）。

图2 对照组和NaCl处理组枯草芽孢杆菌JZXJ-7组胺降解代谢物进行多变量聚类分析

组间代谢物的比较分析

通过比较各组比较来评价NaCl处理下枯草芽孢杆菌JZXJ-7的代谢物差异，170 mmol/L NaCl组和对照组的PCA评分散点图明显分离，PC1占51.09%，PC2占23.79%（Q2＝0.992，RX2＝0.849，RY2＝0.999）（图3A1)。同样，340 mmol/L NaCl组的样品与对照组中，PC1占49.51%，PC2占19.41%（Q2＝0.935，RX2＝0.693，RY2＝0.998）（图3A2)。因此，对照组和NaCl组之间的代谢物存在显著差异。然而，两个NaCl处理组的代谢物相似，但170 mmol/L NaCl组的sample-S3与340 mmol/L NaCl组聚集。两个NaCl处理组之间的PC1和PC2分别为51.79%和22.02%（图3A3）。OPLS-DA的S图分析组间DMs的变化显示，右上角和左下角以红色（VIP≥1）和绿色图（VIP＜1）表示显著代谢物，红色和绿色图相对分散，表明枯草芽孢杆菌170 mmol/L NaCl组的DMs变化显著（图3B1）。与对照相比，340 mmol/L NaCl组中枯草芽孢杆菌的DMs图相对集中，表明DMsFC较少（图3B2）。增加的红色图表明340 mmol/L NaCl组DMs上调高于170 mmol/L组（图3B3）。火山图主要用于显示两组之间具有统计学意义的相对代谢物差异。与对照组相比，170 mmol/L NaCl组中选定的DMs数量为268个，其中71个上调，197个下调（图3C1），而340 mmol/L NaCl组为440324个上调，116个下调（图3C2）。当比较两个NaCl组中的DMs时，214个上调，21个下调，表明较高的盐胁迫促进枯草芽孢杆菌代谢上调（图3C3）。

DMs的KEGG功能分析揭示了枯草芽孢杆菌的代谢途径上调和下调。与对照组相比，170 mmol/L NaCl组的KEGG富集途径集中在次生代谢物、ABC转运蛋白和氨基酸的生物合成上（图4A）。然而，在340 mmol/L NaCl组中，重点是辅助因子的生物合成和半乳糖代谢（图4B）。糖调节代谢与B耐受性增加密切相关。枯草生物在组胺降解过程中受到NaCl应激。几项植物研究已证明，当受到非生物胁迫时，糖的积累与代谢调节之间的关联。两个NaCl处理组之间上调途径的差异主要与次生代谢物和辅因子的生物合成有关（图4C）。

前50个氨基酸及其代谢物分析

氨基酸代谢是影响最大、DMs数量最多的通路。在组胺降解过程中，在枯草芽孢杆菌中检测到对照组和NaCl组之间前50个氨基酸及其代谢物的变化（log2 FC＞1或log2 FC＜-1），如图5所示。在NaCl基团中检测到的42种上调DMs可能与高盐胁迫激活枯草芽孢杆菌氨基酸代谢有关。170和340 mmol/L NaCl组DMs升高主要是乙酰化氨基酸（N-乙酰-L-酪氨酸、N-乙酰-L-亮氨酸、N-乙酰-L-谷氨酸和N-乙酰甘氨酸）。

不同代谢物的代谢物集富集分析和代谢途径分析

DMs的MSEA证明了枯草芽孢杆菌JZXJ-7组对照和NaCl胁迫之间的代谢差异。NaCl组中枯草芽孢杆菌上调的主要氨基酸代谢途径是L-精氨酸、L-脯氨酸、D-谷氨酰胺、L-组氨酸和氨酰-tRNA生物合成和L-赖氨酸降解（图6A-B）。两个NaCl组的甘油磷脂代谢都与胆碱合成有关。在盐胁迫下，胆碱吸收增加并氧化成非代谢性渗透性甜菜碱，从而增强细胞通透性。两个盐胁迫组之间的代谢差异主要归因于半乳糖、果糖、甘露糖、淀粉、蔗糖和谷胱甘肽代谢的激活（图6C）。

根据显著变化的代谢途径，确定生物素代谢和赖氨酸生物合成产生的L-赖氨酸通过甲酰辅酶A进入赖氨酸降解途径，并通过一系列代谢途径进入柠檬酸盐循环（图7A）。乙酰辅酶A是生化代谢的关键。通过TCA循环和氧化磷酸化，乙酰辅酶A被氧化产生CO2和H2O，释放能量用于ATP合成。

枯草芽孢杆菌对赖氨酸的降解是激活TCA循环以进行能量循环的关键。170 mmol/L NaCl组中赖氨酸和中间体的显著下调表明赖氨酸降解在低盐度暴露时最活跃在暴露于抗生素芳樟醇的单核细胞增生李斯特菌中也报道了类似的氨基酸代谢激活。下调的L-精氨酸可以参与肌酸合成，肌酸在包括ATP在内的高能磷酸键的储存和转移中起重要作用。下调的脯氨酸代谢导致谷氨酰胺产生，谷氨酰胺进入氨酰tRNA合成途径（图7B）。NaCl处理组中谷氨酰胺的增加反映了脯氨酸代谢的激活。氨酰基-tRNA合成的激活导致氨基酸转移到其同源tRNA并促进细菌细胞中的蛋白质翻译。与对照组相比，枯草芽孢杆菌JZXJ-7在NaCl氨酰合成途径前体中使用的氨基酸主要包括L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸和甘氨酸。芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）的积累增强了抵抗NaCl诱导的细菌细胞应激的耐受性（图7C1-C2）。如图7D-E所示，组氨酸降解提供谷氨酸作为合成谷胱甘肽的前体。

与170 mmol/L NaCl组相比，340 mmol/L NaCl组的3种碳水化合物代谢途径显著增强，D-葡萄糖和D-果糖在细菌细胞中积累（图7F）。葡萄糖作为细菌生长所需的能量来源参与磷酸戊糖途径（PPP）。在果糖和甘露糖代谢途径中，D-果糖和D-甘露糖等代谢物在氨基糖和核苷酸糖代谢中起前兆（图7G）。在淀粉和蔗糖代谢中，细胞外淀粉的分解转化为麦芽糖，最后代谢为D-葡萄糖，进入TCA循环，在适应压力环境期间增加能量供应（图7H）。

图8显示了枯草芽孢杆菌JZXJ-7在盐胁迫下提高组胺降解效率的机制。在组胺降解过程中，NaCl胁迫显著提高了Na+/K+-ATP酶活性，以维持渗透压平衡并激活抗氧化酶，包括CAT、GST和SOD活性，以减少氧化应激。盐胁迫促进氨基酸代谢，主要代谢途径包括D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和组氨酸代谢、L-赖氨酸降解和氨酰基-tRNA生物合成，而碳水化合物代谢包括半乳糖、果糖、甘露糖、淀粉和蔗糖代谢被激活以释放能量并为TCA循环提供前体。NaCl的添加促进了枯草芽孢杆菌JZXJ-7的代谢能力，促进了组胺的降解。

Conclusion

研究了NaCl胁迫对枯草芽孢杆菌JZXJ-7生长、抗氧化能力、渗透调节和代谢途径激活的影响，以揭示组胺降解的机制。NaCl应激激活了晚期细胞生长（32～48 h）并增加了CAT、GST和SOD酶活性，上调了抗氧化防御，从而显著降解组胺。代谢组学揭示了氨基酸及其代谢物、苯和取代衍生物、有机酸及其衍生物和杂环化合物的参与，所有这些都参与支持枯草芽孢杆菌JZXJ-7的组胺降解。相关的富集代谢途径包括L-赖氨酸降解、L-精氨酸、L-脯氨酸、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、L-组氨酸、甘油磷脂代谢和氨酰基-tRNA生物合成代谢。暴露于较高浓度的NaCl会上调半乳糖、果糖、甘露糖、淀粉、蔗糖和谷胱甘肽代谢。盐胁迫对激活枯草芽孢杆菌JZXJ-7的代谢和能量供应系统以显著降解组胺具有积极作用。这些结果丰富了对盐胁迫如何增强细菌代谢上调生物胺降解的能力的愿景和见解。

Comparative metabolomics reveal histamine biodegradation mechanism by salt stressed Bacillus subtilis JZXJ-7

Rundong Wanga,b,c, Yijia Denga,b,c,*, Yuhao Zhangb,d,*, Xuepeng Lic, Ravi Gooneratnee, Jianrong Lib,c

a College of Food Science and Engineering, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, China

b College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

c College of Food Science and Engineering, Bohai University, Jinzhou 121013, China

d Chongqing Key Laboratory of Speciality Food Co-built by Sichuan and Chongqing, Chongqing 400715, China

e Department of Wine, Food and Molecular Biosciences, Faculty of Agriculture and Life Sciences, Lincoln University, Christchurch 7647, New Zealand

*Corresponding author.

Abstract

Bacillus subtilis JZXJ-7 isolated from shrimp paste can significantly degrade histamine under salt stress but the mechanism is unclear. This study aims to evaluate the effect of 170 and 340 mmol/L NaCl on B. subtilis JZXJ-7 growth, histamine degradation, antioxidant enzymes (catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione S-transferase (GST)) activities and Na+/K+-ATPase activity. Furthermore, comparative metabolomics was used to investigate histamine biodegradation mechanism by B. subtilis JZXJ-7 subjected to salt stress. Both 170 and 340 mmol/L NaCl promoted B. subtilis JZXJ-7 growth in late stages of reproduction (32−48 h), increased histamine degradation rate by 64.85% and 79.87% (P < 0.05), Na+/K+-ATPase activity to 6.28 (P < 0.05) and 11.63 U/mg (P < 0.01) respectively. NaCl treatment significantly increased the activities of CAT, GST and SOD (P < 0.05), amino acids and its metabolites (33.39%), benzene and substituted derivatives (12.05%), heterocyclic compounds (10.62%), organic acids and derivatives (9.75%), aldehydes, ketones, esters (5.59%) and nucleotides and its metabolites (4.58%). Metabolite set enrichment analysis revealed NaCl induced differential metabolic pathways of D-glutamine, D-glutamate, L-arginine, L-proline, histidine and glycerophospholipids, L-lysine degradation, and aminoacyl-tRNA biosynthesis. Exposure to 340 mmol/L NaCl up-regulated carbohydrate, glutathione and glycerophospholipid metabolism. The new insights into the mechanism of salt stress to promote B. subtilis JZJX-7 growth, energy metabolic pathways and to degrade histamine provide the theoretical basis for application of B. subtilis JZXJ-7 in food fermentation industry.

Reference:

WANG R D, DENG Y J, ZHANG Y H, et al. Comparative metabolomics reveal histamine biodegradation mechanism by salt stressed