革兰氏阴性病原菌如肠致病性大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森菌、铜绿假单胞菌、伯克霍尔德菌等均拥有Ⅲ型分泌系统（ Type III Secretion System ， T3SS ）。这些致病菌会利用 T3SS 直接向宿主细胞内注射毒力蛋白（效应蛋白），进而操控宿主细胞信号通路，以利于细菌自身在宿主细胞内的生存、 定殖 和传播【1】。因此，鉴定和解析病原菌 T3SS 效应蛋白的生理功能及 其 分子作用机制，对于深入认识病原微生物的致病机理，进而研发相应的疫苗和治疗性药物具有重要意义 。 紫色杆菌基因组编码了 两 套 T3SS ，分别是 Cpi-1/-1a T3SS 和 Cpi-2 T3SS ；且已有研究表明紫色杆菌的毒力主要依赖于 Cpi-1/-1a T3SS【2】。 紫色杆菌属于胞内菌， 其 清除依赖于宿主细胞的死亡 ，死亡后的宿主细胞再 将其暴露给中性粒细胞 予以清除【3】。在 免疫细胞 中 （如 巨噬细胞 ） ，其 T3SS 装置中的针状蛋白 CprI 可通过激活 NLRC4-caspase-1 炎症小体引发细胞焦亡【4】； 但紫色杆菌与上皮细胞 膜破损型 死亡 进程 之间有怎样的调控关系，此前报道 甚少 。
近日， 南方科技大学 医学院 / 稳态医学研究院李姗团队 联合福建师范大学欧阳松应团队 在 美国国家科学院院刊PNAS杂志 在线发表题为 Pathogen hijacks focal adhesion signaling by a T3SS effector CteX 的论文。文章鉴定出了紫色杆菌T3SS新型效应蛋白CteX，并证实其作为半胱氨酸蛋白酶能够特异性切割宿主黏着斑支架蛋白Paxillinα，进而通过调控宿主细胞骨架重塑实现细菌持续定殖和致病的分子机制，该研究为解析病原菌的致病策略提供了新的视角。
紫色杆菌广泛存在于热带及亚热带的土壤与河流中，属于机会致病菌。但人体一旦感染该菌，可引起严重的皮肤、肝、脾脓肿和坏死，致死率极高【5】。 紫色杆菌 的致病力依赖于其编码的 Cpi-1/-1a T3SS ， 该 系统能向宿主细胞内注射效应蛋白，操控宿主细胞的生理过程，为细菌的入侵、定殖创造条件【6-8】。然而，紫色杆菌 Cpi-1/-1a T3SS 的效应蛋白 组 未 被全面解析， 成为 了 解析该菌致病机制的关键瓶颈 。 为了解决该问题 ，研究团队率先开展了紫色杆菌 Cpi-1/-1a T3SS 分泌 组的定量蛋白质组学分析，发现了一个无已知功能注释的新型分泌蛋白 CV0255 ，并将其命名为 CteX （ Chromobacterium translocated effector X ）。通过分泌和 细胞 转位实验证实 CteX 是 一 个 Cpi-1/-1a T3SS 全新的 效应蛋白。 为 了 探究 CteX 的功能，研究团队解析了其 1.5 Å 的高分辨率晶体结构，发现 CteX 采用典型的木瓜样折叠，具有由 C149 、 H280 、 E295 组成的催化三联体，且存在保守的氧阴离子孔结构。 在真核和原核表达体系 中 ， CteX 蛋白 能够发生自 切割 ，其催化三联体的突变会完全丧失 自 切割 能力， 证实 CteX 是一个 木瓜样 半胱氨酸 蛋白酶 。
CteX 能够显著地抑制酿酒酵母（ S. cerevisiae ）生长，表明其具有真核生物毒性。在 HeLa 细胞中表达时，细胞骨架剧烈收缩 、变圆。为了排除真核过表达体系中因 CteX 蛋白表达量的过高进而可能产生的干扰，我们将原核纯化的 CteX 蛋白递送进入 宿主 细胞，结果显示， 50 pmol /L 的 CteX 蛋白 即可使 100% 的 HeLa 细胞变圆，表明 CteX 具有极强的生物学活性。
研究团队通过底物筛选发现， CteX 能特异性切割宿主 黏着斑的核心支架蛋白 Paxillinα ，而对 Paxillin 家族的其他成员（ Paxillinβ 、 Hic-5 、 Leupaxin ）无切割作用。研究进一步发现 CteX 是通过 “ 双筛选 ” 机制实现底物的严格特异性：其底物结合口袋的疏水凹槽（ L126/L129 ）是切割的必要条件，而相邻的正电荷簇（ K125/K145 ）则负责排斥非靶标底物。 Paxillinα 作为黏着斑的核心，能招募 FAK 、 Vinculin 、 GIT1 等多种信号蛋白形成复合物，调控黏着斑的组装与功能。研究团队通过免疫共沉淀、活细胞成像、邻近生物素化标记（ BioID ）技术等实验证实， CteX 对 Paxillinα 的切割会破坏其与下游信号蛋白的相互作用，导致黏着斑复合物解体，进而引发宿主肌动蛋白细胞骨架的破坏，表现为宿主细胞的变圆表型。
研究团队发现 CteX 介导的细胞骨架重塑并非简单促进细菌入侵，而是呈现出 “ 自限性感染 ” 的独特调控模式。敲除 cteX 基因的紫色杆菌对上皮细胞的入侵效率显著升高，过度的细菌入侵会导致宿主细胞发生剧烈的裂解性死亡，反而使细菌过早暴露于宿主免疫环境中被清除。而野生型细菌通过分泌 CteX 限制过度入侵，减少宿主细胞的死亡，从而实现细菌在宿主细胞内的持续存活。在小鼠感染模型中， Δ cteX 突变株在感染早期的肝脏载菌量显著高于野生型，但在感染后期其定殖能力急剧下降，小鼠的存活率显著升高，且肝脏的病理损伤明显减轻。回补野生型 CteX 能恢复菌株的致病力，而补回蛋白酶失活的 CteX 则无此效果，证实 CteX 的蛋白酶活性是紫色杆菌体内持续定殖和致病的关键。
综上，该研究首次完成了紫色杆菌 Cpi-1/-1a T3SS 分泌组的全面解析，鉴定出新型效应蛋白 CteX ；发现 CteX 是首个直接靶向宿主黏着斑核心蛋白 Paxillinα 的细菌蛋白酶，揭示了病原菌操控宿主黏着斑信号通路的全新方式；阐明了 CteX 家族 通过 “ 自限性感染 ” 调控细菌入侵效率，实现体内持续定殖的独特致病策略，为理解病原菌与宿主的共进化博弈提供了新的范例。
论文的通讯作者是南方科技大学李姗研究员和福建师范大学欧阳松应教授。第一作者是李姗团队博士研究生潘兴、罗纪维和欧阳松应团队 讲师 赵燕波。 特别感谢吉林大学罗招庆教授，南方科技大学饶海教授，华中农业大学李礼研究员对本项目的学术指导和技术支持。
原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2530673123
制版人：十一
参考文献
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3. V. I. Maltez et al. , Inflammasomes Coordinate Pyroptosis and Natural Killer Cell Cytotoxicity to Clear Infection by a Ubiquitous Environmental Bacterium.Immunity43 , 987-997 (2015).
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7. K. Zhang et al. , Structural insights into caspase ADPR deacylization catalyzed by a bacterial effector and host calmodulin.Molecular cell82 , 4712-4726.e4717 (2022).
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