Nature丨微蛋白与微肽扩展人类蛋白质组框架|lncrna|免疫|微蛋白|细胞|翻译|蛋白质

撰文丨啾啾椰

人类基因组中大约有 19,500 个经典蛋白编码基因，这些基因是生物医学研究、疾病机制研究和药物开发的基础。但近年来， Ribo -seq 、质谱和免疫肽组学等技术显示，许多传统上被认为不编码蛋白的非经典开放阅读框，也就是ncORFs（ non-canonical open reading frames ），实际上可能被翻译，产生 microproteins 、 micropeptides 或 SEPs （ small ORF-encoded peptides ）【1,2】。这些 ncORFs 可以位于主 CDS 上游、内部、下游，也可以存在于 lncRNA 中。它们产生的短肽可能参与疾病、癌症和免疫抗原呈递，尤其在肿瘤免疫治疗中， ncORF -derived HLA-presented peptides 可能成为新的靶点【3】。

然而，检测到翻译信号或短肽，是否足以说明一个 ncORF 是真正的蛋白编码基因？如果标准过于宽松，可能会把短暂存在、低可信度或背景翻译事件误认为新的蛋白编码基因；如果标准过于保守，又可能忽略真实存在且有功能意义的小蛋白。传统蛋白注释体系，如 GENCODE 、 UniProt 和 HUPO-HPP ，对蛋白证据要求较高，而 microproteins 通常长度短、丰度低、保守性弱，常规标准很难完全适用。

近日，致力于鉴定并注释人类 ncORF 的 TransCODE Consortium 国际合作团队在Nature上发表了题为Expanding the human proteome with microproteins andpeptideins的文章，建立了一个更系统的ncORF蛋白证据评估框架。

为了验证人类 ncORFs 中有多少能够产生可检测的 peptide 或 microprotein ，作者分析了7,264个由GENCODE支持的ncORFs，并将其与 PeptideAtlas 中的大规模质谱数据进行比对。数据包括常规蛋白消化质谱和 HLA 免疫肽组学。相比传统质谱，HLA数据给出了更多ncORFpeptide证据，检测到3,116个ncORF-derived peptides，对应1,785个ncORFs，占全部ncORFs的24.6%。

图 1 ： HLA PeptideAtlas 里检测到的 ncORFs .

文章还提出了 ORBL （ ORF relative branch length ）方法，用来评估 ncORF 的进化约束。传统方法通常关注氨基酸序列是否保守，例如 PhyloCSF ，但许多 microproteins 很短，且可能快速演化，因此不一定表现出典型蛋白编码基因的氨基酸保守性。 ORBL 关注 ORF 结构本身是否被保留，包括 start codon 、 stop codon 和 reading frame 的开放状态。作者发现，许多 ncORFs 虽然 PhyloCSF 分数不高，但在 ORBL 层面表现出 ORF 结构保守性。

基于这些证据，作者建立了 ncORF 分级框架，综合考虑 Ribo -seq 、传统质谱、 HLA 免疫肽组学、人工检查、进化约束和功能证据。其中 Tier 1A 代表有传统蛋白质组学支持的候选 protein-coding genes 。最初得到 37 个临时 Tier 1A ncORFs ，经过严格人工筛选后保留 15 个候选，其中 3 个已被 GENCODE 注释为蛋白编码基因。对于那些有明确翻译和 peptide 证据，但功能、保守性或常规蛋白证据仍不足以支持其成为经典蛋白编码基因的 ncORFs ，作者提出了 peptidein 概念。

为了进一步探索 peptidein 是否具有功能，作者整合了CRISPR screening数据，筛选具有功能表型的ncORFs。其中一个重点例子是位于 lncRNA OLMALINC ，也称 LINC00263 ，上的 c10riboseqorf92 。这个 ORF 编码一个 123 aa 的 peptidein 。 CRISPR knockout 显示它在大量细胞系中造成细胞增殖或存活缺陷，并且重新表达该 peptidein 可以补偿细胞缺陷，说明相关功能很可能来自这个 ORF 编码产物，而不只是 lncRNA 分子本身。