来源：市场资讯
（来源：张崇敬课题组）
大家好，今天分享一篇发表在JACS上的文章，题目是“A Versatile Bioorthogonal Theranostic Platform Enables Relay Activation of Tumor Cell Imaging and Targeted Protein Degradation”，通讯作者是来自中国科学院上海药物研究所的张翾研究员、陈奕研究员和张秋萌副研究员。
背景介绍
靶向蛋白降解(TPD)由分子胶降解物(MGDs)和蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)驱动，使传统上无法成药的靶点得以调节，几种MGDs和PROTACs已经进入临床试验，然而，全身给药是一个重大的挑战，因为健康组织中靶蛋白非预期降解可能导致靶外毒性。因此，开发创新的策略来减轻毒性、提高选择性并扩大治疗窗口对于成功的临床转化至关重要。
生物正交化学为肿瘤靶向前药激活提供了强有力的策略。其中，反式环辛烯(TCO)与四嗪的反电子需求IEDDA反应因其快速的动力学、显著的生物正交性和良好的生物相容性而特别具有优势。
已经探索了两种成熟的生物正交策略来控制PROTAC的激活。一种策略是将PROTAC连接子切割成两个单独的片段，停止这一过程并防止POI的降解，PROTAC活性的恢复可以通过生物正交链接子重组来实现，从而触发降解过程。虽然这种方法已经在各种PROTAC架构上展示了可行性，但优化链设计以实现高效的POI降级仍然是一项复杂且耗费资源的工作。
另一种策略是将生物正交基结合到E3结合部分，暂时阻断PROTAC-E3相互作用。在激活生物正交反应后，降解物恢复其招募E3的能力，恢复蛋白酶体对POI的降解。这种方法已经成功地应用于招募VHLE3连接酶的PROTAC。然而，它的扩展到基于CRBN的PROTAC和MGDS仍然是一个挑战。两大障碍阻碍了进展：CRBN配体在恶劣的反应条件下固有的不稳定性，以及需要优化生物正交反应动力学以进行有效的激活。鉴于CRBN的MGDS和PROTAC的广泛临床开发，建立一个强大通用的生物正交平台是推进精确靶向蛋白质降解的当务之急。
在这里，作者提出了一个通用的双功能生物正交平台，专为CRBN衍生的降解物量身定做。通过谷胱甘肽(GSH)反应连接体将近红外(NIR)报告器连接到四嗪衍生的触发器(图1)。实现了联动激活机制，同时促进了肿瘤细胞成像和靶向蛋白质降解。
图1.生物正交诊疗平台的设计
实验结果：
1.开发基于CRBN的MGDS和PROTAC的通用前药设计策略
为了建立一种可推广的前药设计方法，作者选择了CC-885（一种靶向GSPT1的MGD）作为前药设计的母体化合物。作者在TCO和戊二酰亚胺单元之间引入了对氨基苯甲基(PAB)连接体，生成了Pro-CC-885-A(图2A)。在四嗪介导的TCO裂解有效进行的同时，Pro-CC-885-B的过度稳定性阻碍了随后PAB连接子的自焚裂解，从而阻止了活性MGD的释放。为了克服这一限制，作者重新设计了前药，加入了基于氨基甲酸甲酯的自焚基团，产生了Pro-CC-885(图2A)。将四嗪可裂解策略扩展到PROTACs，成功地开发了BET降解物dBET6的生物正交前药Pro-dBET6(图2B)。理论上，通过TCO和四嗪之间的IEDDA反应活化后，得到的不稳定的末端氨基甲酸发生自发脱羧基，形成N-氨甲基亚胺中间体，然后通过胺型重排转化为天然母体亚胺(图2C)。
图2.TCO掩蔽的MGDS和PROTACs前药设计
2.四嗪生物正交触发器的设计与表征
与体积庞大的TCO笼状前药不同，四嗪的致密结构有助于功能化。作者的研究包括通过二硫键将近红外荧光团CyNH2与1，4-二氢四嗪衍生物(II-1)连接形成XZ2223，这是一种四嗪衍生的生物正交触发器(图3A)。这种连接体结构能够使肿瘤优先激活，因为癌细胞中较高的GSH水平有助于二硫化物的裂解。裂解后，自环化反应释放近红外荧光团进行成像，同时暴露四嗪以按需启动前药激活。
为了评价GSH对四嗪前体物XZ2223中二硫键的激活作用，采用LC-MS对其进行了动态跟踪。正如预期的那样，XZ2223被迅速消耗，并在1小时内检测到其切割产物，包括CyNH2-SH和Tz-SH(图3B)。随着时间的推移，CyNH2-SH经历了完全的自环化，同时，Tz-SH最初被转化为1，4-二氢四嗪衍生物II-1，随后在数小时内被氧化成生物正交触发器Tz。
为了进一步验证GSH处理后XZ2223释放的CyNH2，对其光学性质的变化进行了表征。XZ2223和XZ2223-NC在约610和660 nm处有两个吸收峰，而CyNH2在688 nm处有一个特征峰。XZ2223与GSH孵育后，610和660 nm处的吸收峰消失，而688 nm处的吸收峰增强，与CyNH2的光谱特征相符(图3C)。在荧光光谱中也观察到类似的趋势(图3D)。加入GSH后，XZ2223在710 nm处出现一个新的发射峰，与CyNH2的特征荧光一致。相反，XZ2223-NC在GSH处理后没有表现出光谱变化，证实GSH选择性地触发了XZ2223中CyNH2的释放。作者接下来评估了XZ2223在细胞模型中的成像潜力，XZ2223处理A549细胞3h后加入外源GSH，诱导出一个强烈的荧光信号(图3E)，相反，XZ2223-NC在相同条件下没有显示出明显的荧光。
图3.GSH激活XZ2223可在体外触发近红外报告分子和生物正交四嗪的释放
3.XZ2223激活Pro-CC-885，在A549肺癌细胞中进行细胞成像和GSPT1降解
接下来，作者研究了肿瘤细胞中的内源性GSH是否可以类似地产生荧光信号，并通过生物正交反应介导的键断裂激活前药，实现靶蛋白降解(图4A)。
在使用A549细胞系进行的细胞成像分析中，XZ2223处理后最初没有检测到近红外信号，信号随时间增加，在共同孵育5小时后信号非常强(图4B)。为了研究癌细胞中GSH水平升高是否有助于XZ2223的优先激活，作者在正常肺成纤维细胞系MRC-9中进行了细胞成像分析。观察到非常微弱的荧光信号(图4C)，这与作者的假设一致。
受到在A549和MRC-9细胞系之间观察到的不同细胞成像效应的启发，作者研究了药物暴露后GSPT1蛋白的动态变化。与前药设计原则一致，Pro-CC-885单独对GSPT1的表达没有可检测到的影响，而CC-885即使在低浓度下也能诱导GSPT1的有效降解(图4D)。Pro-CC-885与XZ2223共孵育后，GSPT1水平呈剂量依赖性降低(图4E)，而阴性对照XZ2223-NC则没有影响。值得注意的是，与A549细胞相比，相同的方案在MRC-9成纤维细胞中诱导的GSPT1降解效率显著降低(图4F)。时间历程分析显示，前药物激活后迅速靶向结合，大部分GSPT1在XZ2223激活后8小时内耗尽(图4G)。机制研究证实，降解依赖于UPS途径，因为MG-132、Bortezomib或泛素化酶抑制剂MLN4924预处理可恢复GSPT1水平(图4H)。
随后，作者评估了这些化合物在A549细胞系中的抗增殖活性(图4I)。与WB结果一致，Pro-CC-885单独对A549细胞没有细胞毒性，而与XZ2223一起激活后，其细胞毒性水平与亲本化合物CC-885相当。另一方面，MRC-9成纤维细胞似乎对CC-885处理敏感(图4J)。然而，XZ2223和Pro-CC885的共同作用导致细胞毒性显著降低，突出了依赖GSH的生物正交平台的优势。
图4.XZ2223介导的MGD前体药物Pro-CC-885的激活
5.XZ2223激活Pro-dBET6，在Huh-7人肝癌细胞中进行细胞成像和BET家族蛋白的降解
接下来，作者研究了TPD生物正交系统是否可以应用于CRBN衍生的PROTAC(图5A)。在与XZ2223孵育开始时，无论是否存在Pro-dBET6，都没有观察到可检测到的近红外荧光信号(图5B，5C)。然而，荧光强度以时间依赖的方式逐渐增强，共孵育5h后检测到强信号，支持XZ2223适合于跨不同癌细胞系的成像。
在建立了XZ2223在Huh-7细胞中的近红外成像能力后，作者接下来评估了它激活Pro-dBET6并触发dBET6的生物正交释放的能力。虽然dBET6显示出强大的BET蛋白质降解能力，但它转化为前药Pro-dBET6有效地取消了这一活性(图5D)。然而，与XZ2223共同处理后，PROTAC dBET6经过了生物正交活化，恢复了降解BRD4、BRD3和BRD2的能力，实现了与亲本PROTAC dBET6相当的降解效率(图5E)。而与XZ2223-NC共孵育则不能诱导BET蛋白的降解。在MRC-9成纤维细胞中应用类似的方法，与Huh-7细胞相比，BRDs的降解能力降低(图5F)。与预期一致，XZ2223引发的Pro-dBET6的降解既是时间依赖的，也是蛋白酶体依赖的(图5G，H)。
虽然Pro-dBET6单独或与XZ2223-NC共孵育都没有明显的细胞毒性，但与XZ2223共同处理后，对Huh-7细胞的细胞毒作用与亲本化合物dBET6相当(图5I)。此外，尽管dBET6对MRC-9成纤维细胞具有中等的细胞毒性，但Pro-dBET6单独或被XZ2223激活都不会产生明显的细胞杀伤效应(图5J)。在BET降解和细胞毒性方面的这种不同反应表明潜在的增强的安全性。
图5.XZ2223诱导PROTAC前药Pro-dBET6的激活：机制和意义
6.XZ2223能够在小鼠异种移植模型中实现肿瘤成像、靶蛋白降解和抗肿瘤疗效的继发激活
在细胞成像和POI降解研究的鼓舞下，作者下一步试图在体内验证生物正交平台。作者通过直接将XZ2223注射到小鼠异种移植模型的肿瘤中来启动体内评估，然后通过腹腔注射系统性给药降解剂前药(图6A)。
如图6B所示，XZ2223的注入产生了即时的荧光信号，这归因于其固有的光学性质。信号逐渐增强，在6小时达到峰值，表明XZ2223被原位转化为近红外报告分子CyNH2。值得注意的是，荧光持续了24小时以上，表明四嗪部分可持续用于潜在的前药激活。此外，解剖后内脏的荧光成像在注射后6小时显示强烈的肿瘤特异性信号，在心、肝、脾、肺、肾和胃中观察到极少量的荧光。
接下来，作者研究了生物正交平台是否可以在系统施用Pro-CC-885或Pro-dBET6后实现有效的POI消除。在30 mg/kg的剂量下，单独的Pro-CC-885仅诱导最小的GSPT 1下调。相比之下，与XZ2223联合给药导致GSPT 1的剂量依赖性降解（图6C）。类似地，Pro-dBET 6被成功激活，导致BRD 4、BRD 3和BRD 2的大量消耗（图6D）。
最后，作者在Huh-7异种移植模型中评估了该治疗平台的抗肿瘤效果(图6E)。单独给予dBET6或Pro-dBET6只能导致有限的肿瘤生长抑制。相反，正如预期的那样，XZ2223和Pro-dBET6联合治疗产生了增强的治疗效果(图6F)。此外，dBET6治疗与全身毒性有关，体重减轻证明了这一点，而Pro-dBET6单独或与XZ2223联合使用都没有引起显著的毒性(图6G)。
图6.XZ2223在小鼠异种移植模型中诱导肿瘤成像、靶蛋白降解和抗肿瘤活性的继发性激活
基于CRBN的MGDs和PROTACs已成为临床应用的有效治疗手段，在各种疾病中提供有针对性的蛋白质降解。然而，靶蛋白在健康组织中无差别降解仍然是一个重大挑战，可能导致不良的靶外毒性。作者建立了一种为基于CRBN的双功能生物正交前药平台，设计了XZ2223，一种GSH响应型生物正交触发器，能够同时释放用于标记肿瘤细胞的近红外荧光探针和用于激活TCO-笼状前药的四嗪衍生物。利用外源GSH和内源GSH对XZ2223在活细胞中的切割机制进行了系统的研究。结果表明，它能够激活基于CRBN的MGDs和PROTACs，通过荧光和靶蛋白降解同时进行癌细胞标记，最终导致癌细胞死亡。通过将肿瘤选择性成像和精确的蛋白质降解集成到单一平台中，该策略代表了一种具有治疗潜力的多功能生物正交治疗平台。
与通常需要单独给药以防止过早激活的传统TCO/四嗪生物正交反应不同，利用可切割GSH的1，4-二氢四嗪衍生物，促进前药和生物正交触发器的联合给药。值得注意的是，XZ2223与相应的前药在小鼠异种移植模型中实现了强大的肿瘤成像和GSPT1或BRDs蛋白的有效降解。XZ2223与Pro-dBET6的组合产生了增强的抗肿瘤效果，同时降低了相对于母体降解物dBET6的全身毒性。
对于潜在的临床转化，这两种成分的药代动力学曲线必须彻底优化，以确保有效的肿瘤积累和受控激活。另一个考虑是在这项研究中采用的荧光成像策略。所使用的近红外荧光团在第一近红外窗口内工作，该窗口提供中等的组织穿透性，但容易受到背景自发荧光的影响。为了提高临床前和临床应用的成像效率，过渡到第二个近红外窗口荧光团将是有利的。此外，XZ2223对肿瘤的选择性激活依赖于癌细胞比正常细胞固有的更高的细胞内GSH水平。然而，鉴于不同肿瘤类型之间的GSH浓度和差异性不大，单靠GSH可能不足以实现绝对的肿瘤特异性。为了进一步提高肿瘤的选择性和/或组织特异性，四嗪衍生物上的炔基可用作结合靶向细胞表面受体的抗体或小分子配体的化学手柄。这样的修饰可以改善肿瘤微环境中的靶向递送和空间受限激活，从而进一步降低靶向毒性和提高治疗精度。
总结
在这项研究中，XZ2223，一种GSH可裂解的四嗪前体，显示出很强的标记癌细胞和激活来自CRBN MGDs和PROTACs的TCO笼前药的潜力。值得注意的是，XZ2223与Pro-CC-885或Pro-dBET6共同给药能够有效地进行生物正交激活，分别触发GSPT1和BRDs的按需降解。激活的和未激活的前药之间在生物活性方面的明显差异突显了这一策略的潜力，即通过最大限度地减少靶外毒性，同时保持强大的抗癌活性来扩大治疗窗口。通过将荧光引导的肿瘤成像与时空可控的蛋白质降解相结合，这个多功能的生物正交治疗平台为精确和可控的癌症治疗提供了一种双重功能的方法，为靶向药物激活和精确肿瘤学的进一步发展铺平了道路。
文献整理：Yang Yidan
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