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Introduction
近年来，随着消费意识和水平的提高，消费者对啤酒的需求正朝着多样化和个性化方向发展。啤酒花作为啤酒酿造中必不可少的原料之一，赋予了啤酒优美的芳香和爽口的苦味。目前，使用更为丰富的啤酒花品种以及更大的添加量已成为啤酒新品研发的趋势，市场上出现了如IPA（印度淡色艾尔）等苦味型啤酒，其是以往主流的淡爽型黄啤酒中啤酒花的添加量的数倍以上。然而，高苦味啤酒发酵过程中后期的酵母活力减弱问题已引起了国内外啤酒科技工作者的关注。青岛农业大学邓阳教授课题组研究证实，当高浓度苦味酸存在条件下，啤酒酵母可逐渐形成活的不可培养（Viable but non-culturable，VBNC）状态，此时细菌仍具有细胞的完整性，但只保持低水平的代谢活性，这在一定程度上制约了高苦味啤酒的正常发酵。而且，目前对VBNC状态形成的研究仍主要集中于原核生物，关于酵母等真核生物的研究报道还非常少。此外，酵母与细菌在细胞结构和生命活动等诸多方面存在差异，所以两者的VBNC状态形成机制可能略有不同。因此，针对高苦味啤酒酿造过程中酵母的活性变换及其机理的深入解析则显得尤为重要。
研究结果
本课题组前期研究发现，酵母经300 mg/L异α-酸处理2 h后，可培养菌数降到零，此时活菌数约占总菌数的90.2%；2 500 U/mL过氧化氢酶培养48 h可使VBNC酵母复苏至可培养状态。采用比较转录组学和生物信息学手段，比较正常、短期胁迫和VBNC酵母的基因表达量，调控VBNC状态形成的关键功能基因；再结合GO和KEGG富集分析，推测出过氧化物酶体通路是啤酒酵母VBNC状态形成过程中的关键通路，而此通路上的POX1基因的表达差异倍数较高，可能对于VBNC状态啤酒酵母的形成起到关键调控作用（LWT-Food Science and Technology, 2022, 155:112974）。为了验证这个猜测，作者通过基因敲除和过表达技术构建啤酒酵母POX1基因缺失菌株和过表达菌株以阐明POX1基因在啤酒酵母VBNC状态的形成过程中的作用机制，同时分析了VBNC状态的形成与氧化应激反应的关系。
图1不同信号肽对枯草芽孢杆菌分泌α-LA的影响
作者首先证实，随着酵母所处胁迫程度的增加，ROS含量、CAT酶活、SOD酶活、GR酶活逐渐提高，酶调控关键基因SYM1、CTA1、SOD1、GLR1的mRNA相对表达量也呈现上升趋势，当酵母处于VBNC状态时，达到最高值。由此可以推测，酵母VBNC状态的形成与氧化应激反应有关。其次，以质粒pUG6为模板，构建出POX1基因缺失菌株，在300 mg/L异α酸处理2 h后，细胞死亡，说明POX1基因在啤酒酵母VBNC状态形成过程中非常重要。随后，分别测定了正常状态、VBNC状态和POX1基因敲除菌株细胞内ROS含量变化，结果发现POX1基因敲除菌株细胞内ROS荧光强度约为181.5，显著低于正常状态酵母，进一步证实POX1基因的缺失会影响酵母的ROS代谢，说明POX1基因与酵母的氧化应激反应有密切关系。另外，构建出POX1基因过表达菌株，发现POX1基因过表达菌株比原始菌株更容易进入VBNC状态，说明POX1基因在酵母VBNC状态的形成过程中起到关键作用；通过分析酵母细胞内ROS含量的变化可知，经异α酸诱导后，VBNC状态的POX1基因过表达菌株中ROS含量显著高于正常状态的原始菌株和POX1基因过表达菌株以及处于VBNC状态的原始菌株，说明POX1基因与酵母的氧化胁迫反应存在内在关联。本研究为解决苦味型啤酒发酵过程中酵母活力减弱的问题提供新思路和方法，也为进一步完善真核生物VBNC状态形成机制奠定理论基础和科学依据，具有重要的学术价值及生产指导意义。
第一作者简介
王增艳，女，硕士，毕业于青岛农业大学食品加工与安全专业，主要研究方向为食品微生物与生物技术。参与国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金青年科学基金等科研项目，在国内外期刊公开发表学术论文5 篇，其中以第一作者发表SCI收录论文2 篇，申请国家发明专利1 件。
通信作者简介
邓阳，男，博士，青岛农业大学食品科学与工程学院教授、硕士生导师，获青岛市城阳区创新创业领军人才称号，入选青岛农业大学第一批优秀人才“特支计划”骨干人才。兼任特种食品营养与创制山东省工程研究中心副主任、青岛特种食品研究院科研处处长、Frontiers in Microbiology客座副主编、全国酿酒标准化技术委员会委员、国家自然科学基金评审专家。长期从事微生物新资源食品制造及质量调控的应用基础研究。近年来，主持国家重点研发计划子课题、国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金青年科学基金、科技部“一带一路”创新人才交流外国专家项目、中国博士后科学基金特别资助等12 项科研立项；以第一或通信作者发表SCI收录论文26 篇，获授权国家发明专利5 件。
POX1 regulates the formation of viable but non-culturable brewer’s yeast induced by iso-α acid from hops
Zengyan Wanga,b,c,d,1, Yang Xiaoa,e,1, Xuchen Lia,b,c,d,1, Zhenqing Lia,b,c,d, Yan Wangf, Wei Hef, Jiayang Wanga,b,c,d, Li Liua,b,c,d, Ting Dinga,b,c,d, Pengdong Suna,b,c,d, Jingyuan Lia,b,c,d, Yang Denga,b,c,d,*
a College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
b Key Laboratory of Special Food Processing (Co-construction by Ministry and Province), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
c Shandong Technology Innovation Center of Special Food, Qingdao 266109, China
d Qingdao Special Food Research Institute, Qingdao 266109, China
e School of Food Engineering, Qingdao Institute of Technology, Qingdao 266300, China
f Shandong Huifa Foodstuff Co., Ltd., Zhucheng 262200, China
1 Zengyan Wang, Yang Xiao, and Xuchen Li contributed equally to this manuscript.
*Corresponding author.
Abstract
In this study, we utilized gene knockout and overexpression techniques to generate brewer’s yeast strains with either a deletion or overexpression of the fatty acyl-CoA oxidase (POX1) gene. The strains studied included the parental strain, the POX1 deletion strain, and the POX1 overexpression strain. These strains were exposed to iso-α acid from hops at a concentration of 300 mg/L, leading to the induction of a viable but non-culturable (VBNC) state. Our results indicated that the silencing of the POX1 gene rendered brewer’s yeast cells unable to withstand the high concentration of iso-α acid stress, ultimately leading to cell death. Conversely, the overexpression of POX1 accelerated the transition of yeast cells into the VBNC state compared to the parental strain. Furthermore, we evaluated the levels of reactive oxygen species (ROS), catalase (CAT) activity, superoxide dismutase (SOD) activity, glutathione reductase (GR) activity, and the mRNA expression of genes that regulate these enzymes (the stress-inducible yeast Mpv17 (SYM1) gene, CTA1, SOD1, and glutathione reductase (GLR1) gene) in brewer’s yeast cells at three distinct stages: normal, short-term stress, and VBNC states. Based on these findings, it can be inferred that the formation of the VBNC state in brewer’s yeast is associated with the response to oxidative stress.
Reference:
WANG Z Y, XIAO Y, LI X C, et al. POX1 regulates the formation of viable but non-culturable brewer’s yeast induced by iso-α acid from hops[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(6): 9250150. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250150.
本文编译内容由作者提供
编辑：王佳红；责任编辑：孙勇
封面图片：图虫创意
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