临床前模型导致肿瘤药物开发失败的原因及潜在改进策略|免疫性疾病|特异性|细胞系|肿瘤细胞|靶点

美国FDA数据显示，动物实验中显示安全有效的药物，绝大多数因在临床安全性/疗效不佳未获批准。临床前测试向早期临床试验转化的高失败率，主要源于模型系统（体外/体内）的缺陷和实验策略的不当。本文分析下失败率居高不下的可能原因及潜在解决方案。

细胞培养模型的问题

（一）二维与三维模型的差异

新型候选药物的初步评估多始于细胞培养模型，合理选择与药物作用机制匹配的肿瘤模型是实验的关键前提。

1.二维（2D）模型

以实体瘤单层培养、血液肿瘤悬浮培养为代表，因操作简便、成本低成为药物研究中生成初步数据的主流模型。但2D细胞培养存在显著缺陷：肿瘤细胞处于营养丰富、高氧环境，呈指数生长，无免疫系统参与，且常被同时暴露于高浓度单药/联合药物中，缺乏药代动力学和代谢过程，与体内真实肿瘤微环境差异极大。

2.三维（3D）模型

主要包括肿瘤球状体和类器官，能更好模拟肿瘤组织的生理特征，是2D模型的重要补充，但存在操作复杂、成本高的问题。肿瘤球状体在全液体培养基中生长，分为单纯型（仅肿瘤细胞）和复合型（肿瘤细胞+内皮细胞、成纤维细胞等基质细胞），可形成细胞间黏附作用和缺氧核心，更接近体内肿瘤组织。比如，NCI60细胞系可在超低吸附板中培养为3D球状体。肿瘤类器官在基质胶中培养，需添加生长因子、细胞因子和小分子激酶抑制剂，以维持干细胞样表型、抑制上皮-间质转化（EMT）。但类器官的构建难度大、维护成本高，导致研究中常退而选择2D模型。

（二）细胞系的选择缺陷

部分被广泛使用的肿瘤细胞系，与临床对应癌症的治疗特征存在显著偏差，导致研究结果的临床转化价值降低，以前列腺癌为例：

临床中去势抵抗性前列腺癌的一线治疗为雄激素阻断疗法，但研究中最常用的PC-3、DU-145细胞系缺乏雄激素受体（AR），对恩扎卢胺等雄激素阻断药物不敏感，与临床疾病特征不符。

更具临床相关性的模型（如表达AR的22Rv1细胞系、LuCaP35CR PDX模型、基因工程小鼠模型GEMM）却极少被使用。此外，将雄激素依赖性LNCaP细胞系改造为去势抵抗性亚型（C4-2、C4-2B），或利用TRAMP、LADY等GEMM模拟人类前列腺癌进展，均为更合理的选择。

需要注意的是，PC-3、DU-145细胞系并非无转化价值——两者均为p53缺陷型，而p53异常是前列腺癌不良预后的标志物，在50%以上的晚期/转移性前列腺癌中驱动疾病进展和耐药，因此在这些细胞系中表现出活性的药物，可能对临床中未被满足需求最高的p53缺陷型前列腺癌亚群有效。

（三）药物浓度的使用不当

临床前体外/体内研究中，抗癌药物的浓度/剂量选择不当是普遍问题。研究者极少为细胞培养中的药物浓度提供合理依据。即使药物获批后临床相关浓度已明确，仍有研究使用不当的模型系统和实验设计，阻碍药物向新适应症/联合方案的拓展。这直接造成药物药代动力学与敏感性/应答之间的显著脱节，典型案例如下（下表为主要药物的临床前与临床浓度对比）：

典型药物案例

1. 替莫唑胺：胶质母细胞瘤（GBM）的标准治疗药物，为前药，在多数细胞中体外活性差；体内活性形式通过DNA碱基甲基化发挥作用，O6-甲基鸟嘌呤是其最具毒性的修饰产物。患者中枢神经系统中的替莫唑胺浓度，远低于多数实验GBM模型中抑制肿瘤生长所需的浓度。仅31%的MGMT低表达/错配修复（MMR）正常的细胞系，在临床相关浓度下对替莫唑胺敏感。

2. 曲美替尼：MEK1/2抑制剂，临床血药峰浓度（Cmax）为21nM，但大量研究仍使用高达1000nM的浓度进行测试。

3. 他拉唑帕利：PARP抑制剂，临床Cmax为43nM，却常被用于200nM及以上的细胞培养研究。

4. 硼替佐米：蛋白酶体抑制剂，临床Cmax为312nM，此前研究中曾使用高达50μM的体外浓度，近年仍有研究使用1-10μM的超临床浓度。

5. 奥希替尼、吉非替尼、达沙替尼、克唑替尼：均为激酶抑制剂，临床前研究中使用的浓度普遍为临床相关浓度的数倍至数百倍。

（四）培养形式对药物敏感性的影响

即使选择了临床相关药物浓度，培养条件和药物暴露时间仍会显著影响药物应答——肿瘤对多种药物的敏感性依赖于生长模式。

以NSCLC细胞系为例，在临床Cmax浓度的EGFR抑制剂（厄洛替尼、阿法替尼、拉帕替尼、奥希替尼）作用下，EGFR L858R突变的LG0703-F948患者来源细胞系，球状体培养时对四种抑制剂均敏感，单层培养时均耐药；EGFR E746-A750缺失的HCC827细胞系，球状体和单层培养时均敏感；EGFR T790M/L858R双突变的NCI-H1975细胞系，球状体培养时对奥希替尼敏感，单层培养时耐药。

这表明细胞表面靶点的表达和药物敏感性随培养形式变化，也是细胞培养与体内实验结果存在一致性/差异性的重要原因。

荷瘤动物研究的问题

（一）PDX的缺陷

与传统的CDX相比，PDX模型直接源于癌症患者，是更接近临床的模型。PDX模型推动了基于肿瘤基因组特征的个体化药物选择，但存在显著局限性：1）成瘤率低、生长缓慢、可重复性差；2）为获得稳定的生长速率而在小鼠中多次传代后，肿瘤会丢失原代肿瘤的部分特征；3）药物开发的时间周期长，针对特定PDX模型筛选的最优治疗方案，临床应用时往往仅能作为二线/三线治疗。

（二）免疫系统在药物作用中的缺失

多数癌症治疗依赖于肿瘤、肿瘤微环境（TME）和ADME的多方面相互作用，而新型肿瘤治疗手段（如免疫检查点抑制剂、免疫激动剂、T细胞衔接器、癌症疫苗）的活性高度依赖人类免疫系统；部分抗体药物偶联物（ADC）的活性也受免疫系统影响（如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性ADCC）。

大部分CDX和PDX模型在免疫缺陷小鼠中开展，完全排除了免疫系统对治疗应答的贡献，而免疫系统是许多癌症药物临床活性的重要决定因素。为弥补免疫系统模拟的缺陷，同基因、嵌合、人源化小鼠模型的应用逐渐增加，这类模型表达相关人类表位且具有完整的免疫系统，各模型的特征如下：

1.嵌合小鼠模型

在免疫健全小鼠中工程化表达含人类表位的蛋白（如MC38-cEGFR、hCD3E-epi、MC38-hPD-L1），也就是通常所谓的靶点人源化动物，可在肿瘤-基质-免疫细胞相互作用的背景下评估新型人源癌症药物。且与全人源化小鼠相比，嵌合模型构建更简单、快速、成本低，通量更高。

缺陷：小鼠免疫系统与人工表达的人类表位存在不匹配，限制了人类免疫细胞特异性生物学的观察（如人类检查点/配体相互作用、抗原呈递、细胞因子信号），降低结果的转化价值。

2.全人源化小鼠模型

根据免疫重建的复杂度、广度、深度和治疗周期，分为不同亚型，各有优劣，适用于不同类型的免疫肿瘤学研究：

·人外周血单个核细胞（huPBMC）模型：2-4周内可重建人类T细胞，适合快速、短期评估T细胞连接器，但易发生异种移植物抗宿主病（xGvHD），干扰炎症评估，无法进行长期治疗。

·人造血干细胞（hu-CD34+）模型和骨髓-肝脏-胸腺（BLT）模型：构建耗时久、技术要求高，需特定供体材料和手术操作，但能实现更广泛、持久的适应性免疫重建，提升疫苗应答和免疫记忆的转化价值。其中BLT模型因使用胎儿胸腺和肝脏来源的CD34+细胞，存在伦理争议，但能实现人类MHC限制和更生理相关的T细胞受体（TCR）库，更适合T细胞中心的免疫肿瘤学评估。

3.细胞因子人源化小鼠模型

hu-CD34+和BLT模型均存在固有免疫细胞表达不足的问题，限制了Fc依赖的效应功能和髓系细胞相关疗法的评估。细胞因子人源化品系可提升NK细胞和髓系细胞的表达，但模型变异性更高，需对人类免疫重建水平和功能进行复杂分析，并验证药物靶点的种间交叉反应性。

模型优化与临床差异

嵌合和人源化模型虽各有取舍，但均显著提升了药物-肿瘤-免疫-基质相互作用的生理相关性评估。

但临床前模型仍无法解决临床研究的人群差异：首次人体（FIH）临床试验通常在复发/难治性（R/R）患者中开展，这类患者的肿瘤（如克隆进化、旁路通路、逃逸机制、靶点下调）和宿主免疫系统（如肿瘤浸润淋巴细胞、调节性T细胞/髓系来源抑制细胞紊乱）与一线治疗初治患者存在显著差异，导致即使在最优小鼠模型中表现出高活性的药物，在FIH研究中疗效也显著降低。也就是所谓的拿一线动物药效数据预测临床末线患者的效果。

（三）当前动物模型的其他核心局限性

1. 未考虑年龄因素：癌症多为老年疾病，老年与年轻小鼠对部分治疗的应答存在显著差异，但因饲养成本高、小鼠衰弱和药物耐受性问题，极少有研究使用老年小鼠。

2. 肿瘤接种部位非生理：皮下侧腹肿瘤接种操作简便，可准确评估肿瘤生长/应答，但极少有肿瘤的天然发生部位为侧腹。原位注射更具生理相关性，但技术难度大、需手术和伤口愈合、治疗应答监测更复杂，依赖无创成像或处死时的单点评估。

3. 免疫缺陷的固有问题：CDX模型几乎均在免疫缺陷小鼠中开展，排除了免疫系统的作用；PDX模型虽更具预测性，但同样在免疫缺陷小鼠中培养，存在相同局限。同基因肿瘤模型保留了小鼠的完整免疫系统，但啮齿类肿瘤和免疫体系与人类存在本质差异。人源化模型（NSG-SGM3、MISTRG、BLT）能结合人源肿瘤和人类相关免疫系统，但仅资金充足的实验室可开展。

4. 肿瘤体积与临床不符：为避免肿瘤体积超过伦理阈值，药物给药通常在肿瘤较小、未充分建立时启动，仅能模拟临床极早期疾病的治疗。而多数癌症患者接受治疗时已存在比较大的肿瘤负荷。

5. 给药途径缺乏临床相关性：新型治疗的研究常采用瘤内注射，而人类癌症治疗以全身给药（口服/静脉）为主；瘤内注射不仅临床相关性低，还可能破坏肿瘤结构，干扰结果解读。

6. 实验周期过短：动物研究的时间框架无法有效预测人类研究的效应：1）肿瘤生长延迟等终点指标过短，无法判断停药后肿瘤是否复发；肿瘤消退评估虽更优，但通常未结合动物生存改善这一临床相关终点；即使报告生存，也常因提前处死溶媒对照组而存在设计缺陷；2）传统异种移植和同基因肿瘤模型生长过快，除非药物疗效显著，否则无法进行多剂量治疗；评估药物的“治愈潜力”需监测小鼠整个生命周期（1.5-2.5年），远长于多数标准小鼠实验；3）短周期实验无法评估药物对肿瘤转移的影响，而转移是癌症相关死亡的最主要原因。

优化策略：①接种更少的肿瘤细胞，延缓肿瘤生长，延长治疗周期；②利用PDX模型生长缓慢的特点，开展多疗程药物治疗。

7.数据合并掩盖异质性：将多只小鼠的数据合并分析，会模糊药物应答的异质性；虽适用于评估平均肿瘤生长抑制（TGI），但无法识别对少数患者具有治愈潜力的药物（如免疫检查点抑制剂）。优化建议：采用单小鼠试验（SMT）设计，评估少数人群的药物效应。

8.啮齿类耐受性向临床的过度外推：小鼠对药物剂量和联合方案的耐受性远高于人类，导致动物模型无法准确预测临床治疗相关不良事件（AE），如心血管毒性、神经毒性、自身免疫病、胃肠道和皮肤反应等，典型案例：1）白介素-12（IL-12）：高剂量（45μg/kg）在小鼠中可有效减少B16黑色素瘤和Lewis肺癌的肺转移，且耐受性良好；但临床中相同剂量的重组人IL-12导致严重的胃肠道毒性、血细胞减少和全身症状，临床应答微弱，目前研究方向已转向肿瘤微环境的靶向递送；2）抗体药物偶联物（ADC）：若药物靶点仅在人类细胞中表达，啮齿类模型会高估ADC的治疗窗口——ADC的活性和毒性依赖于靶点的高表达和高效内化，人源特异性靶点使ADC在小鼠中表现出良好耐受性，但临床中毒性显著升高；且药物-抗体比率（DAR）越高，这种差异越明显（如抗CD30-vc MMAE ADC）。

此外，啮齿类和人类的AE差异还源于遗传背景、免疫通路、激素和代谢调节、微生物组的不同，部分AE仅在人类特异性辅因子存在时发生（如JC病毒相关的病毒再激活）。

细胞培养和荷瘤动物药物测试实验方法的改进

药物候选物的临床活性由多种因素决定，单一模型系统无法复现所有特征，但通过多模型联合分析各关键因素，可提升临床前结果的临床相关性。例如，对有潜力的药物可开展以下测试：免疫缺陷小鼠的CDX/PDX模型；含人类免疫细胞和肿瘤细胞的人源细胞共培养系统；同基因肿瘤模型（使用替代药物，靶点为小鼠肿瘤中天然存在的表位）。

开发更接近临床R/R疾病的模型，可进一步缩小临床前高预期与临床低疗效之间的差距。目前已有针对免疫检查点抑制剂耐药的模型被开发（如抗PD-1耐药的MC38模型、B16黑色素瘤疫苗耐药模型）。尽管无模型能完全复现药物-TME-免疫系统的复杂相互作用，但多模型联合可实现靶点的机制验证和免疫系统的参与评估，显著提升研究结果的整体转化价值。

NCI PMDR异种移植测试的关键发现：临床中有效的药物，在对应的临床前模型中也具有活性。这一发现可通过单小鼠试验（SMT）设计加以利用——即每个PDX模型和治疗组使用一只小鼠（若有足够多的同疾病异种移植肿瘤），该设计可模拟临床试验的异质性，更准确预测临床应答率，从而筛选出对异质性人类癌症患者具有显著临床影响的药物。

此外，FDA正推进新一代无动物临床前模型（NAMs）的开发，以减少/替代动物进行毒性和疗效测试，这类模型包括基于AI的毒性计算模型、正常细胞系和类器官毒性测试，核心类型及应用如下：