人体的免疫系统有时会对蛋白质类药物产生特殊的抗体，即抗药抗体（ADA），这类抗体可能会影响药物的疗效，甚至引发不良反应。令人意外的是，部分人群在从未接受过某类药物治疗前，体内就已存在这类抗体，即预先存在的抗药抗体（pre-ADA）。本文阐述了安进、礼来和罗氏三家制药企业的科研人员如何在药物开发早期研究这类pre-ADA。这点可能颠覆了很多人的理解和认知。毕竟大部分企业在预毒理试验开展前才开始制备ADA阳性抗体，启动非临床方法学开发工作。IND以后才考虑临床ADA方法的开发、验证等工作。国内应该很少有企业在早期药物发现阶段就将ADA风险引入成药性评估中。很少关注预存ADA引发的成药性风险，而这一风险其实在确定候选分子的时候就已经埋下，是需要引起足够重视的。一起来看下安进、礼来和罗氏三家药企的实践经验，能带给我们什么样的启示。这三家药企研究人员在早期药物筛选阶段，通过检测健康人群的血清样本，能够判断一款新药物是否可能引发pre-ADA反应。尽早发现该风险，能让科研人员对药物进行改造或更换候选药物，从而提升新药的安全性和有效性。
尽管pre-ADA的存在已被证实，但其潜在作用机制具有多样性，目前尚未被完全阐明。体液免疫反应可能由某种免疫原初步触发，进而产生与药物中同源表位发生交叉反应的抗体，这类抗体即属于pre-ADA。这种免疫激活的诱因包括：既往接触过结构相似的治疗性蛋白、与针对环境抗原产生的抗体发生交叉反应，或某些疾病及特定患者群体中自身抗体的存在。蛋白类治疗药物常见pre-ADA类型包括抗同种异型抗体、抗铰链区抗体、抗聚糖抗体和抗PEG抗体。
Pre-ADA的临床意义在科学界仍存在争议，已有研究证实部分案例中检测到pre-ADA后，并未观察到明显的临床后果。但随着生物治疗药物剂型的日益复杂，越来越多的研究报道显示，pre-ADA会诱导产生治疗性抗药抗体（TE-ADA），进而在临床应用中对药物的PK、PD、疗效和安全性产生不利影响。葛兰素史克公司的GSK1995057就是一个典型案例，该药物是靶向TNFR1的单重链可变域（VH）抗体。在早期临床试验中，识别VH域的pre-ADA导致高pre-ADA水平的健康受试者出现免疫激活，并引发与细胞因子释放相关的输液反应。为解决该问题，研究人员在该药物C端添加了一个丙氨酸残基，开发出GSK2862277，使pre-ADA的识别率从51%降至7%。这一案例表明，早期开展pre-ADA筛选对于降低免疫原性风险、改善生物治疗药物开发项目的安全性和疗效特征至关重要。
目前行业内尚无评估pre-ADA风险的标准化方法，本文基于三家制药企业的深入研讨，明确下pre-ADA筛选方法的最佳开发时机和策略。
Pre-ADA评估策略的对比概述
评估节点
临床阶段用于免疫原性评估的ADA检测方法，通常在确定临床用分子后才进行开发。在检测方法开发阶段，首次对未接受过治疗的样本进行检测，从而发现pre-ADA的存在。三家企业均已从药物开发后期应对pre-ADA风险，转变为在早期阶段进行风险防控，这一前瞻性转变包括制定并实施pre-ADA早期评估策略。具体而言，三家企业均在先导候选药物筛选阶段开展pre-ADA评估，该阶段比最终候选药物确定提前约6个月。这一筛选时机能够尽早识别pre-ADA风险，便于及时采取干预措施，必要时对候选分子进行改造。
企业2和企业3会对4~6个分子进行筛选，以此对其免疫原性潜力进行排名和对比，确保免疫原性优势最显著的候选药物进入后续开发阶段；企业1则针对最终候选分子开展评估，保证入选的候选药物在进入临床试验前，其免疫原性风险特征已得到充分阐明。注：不清楚企业1、2、3和安进、礼来、罗氏的对应关系。
筛选的研发项目范围
企业1和企业3采用全面筛选策略，对所有研发项目进行pre-ADA反应性检测，通过广泛的筛选实现管线内项目的全面风险评估，尽早发现潜在的免疫原性问题。
企业2则采用靶向筛选策略，仅对被认定为存在潜在风险的研发项目进行检测，例如新剂型、或现有剂型中引入新型工程化结合蛋白并暴露新表位、进而存在免疫原性风险升高可能的项目。该靶向策略能够优化资源配置，将详细评估集中于存在潜在免疫原性问题的候选药物。
此外，各企业均建立了针对自身治疗领域、剂型和药物类型的内部数据库，为潜在风险评估提供支持。
Pre-ADA检测方法策略
三家企业均将pre-ADA评估结果与其他临床前风险评估数据整合，开展全面的风险评估。
用于评估pre-ADA风险的检测方法，要确保检测到的阳性信号是由药物特异性抗体产生，而非非特异性干扰物或其他药物相关干扰因素（如可溶性多聚体或聚集的药物靶点）。三家企业均已建立标准化的pre-ADA评估检测格式和操作流程。
企业1：采用亲和捕获-洗脱（ACE）-桥接ADA检测范式，将药物分子用生物素和钌进行标记。在ACE-桥接检测中，将生物素化的药物分子包被在链霉亲和素板上，捕获血清中的pre-ADA；随后用酸将捕获的pre-ADA洗脱至另一块板中，该板含有等浓度的生物素化药物（Bt-drug）和钌标记药物（Ru-drug）的中和缓冲液，进而形成桥接复合物用于检测。该检测范式与临床开发阶段使用的经过验证的临床免疫原性检测方法一致，能够更可靠地对pre-ADA评估结果与临床免疫原性数据进行相关性分析。在条件允许的情况下，会使用通用阳性对照，如抗人Fc多克隆抗体和抗胰岛素多克隆抗体；同时将包被和未包被缓冲液的孔作为背景对照，以排除检测试剂的非特异性结合或自身聚集。
企业2：针对绝大多数药物候选物中含有的Fc受体沉默突变（PG突变）的分子，采用平台免疫复合物检测方法，无需对药物分子进行标记即可开展筛选。该检测方法通过PG特异性抗体捕获药物，利用FcγR检测ADA。为保证检测一致性并实施质量控制，每块检测板均加入通用阳性对照（由PG修饰药物与模拟ADA-药物复合物的人野生型IgG偶联制备）；同时监测含药和不含药的阴性对照混合血清。研究人员利用预先设定的人血清组（n=40）生成标准化数据集，深入分析pre-ADA反应性，并可在不同药物候选物和研发项目间进行对比。该血清组的适用性已通过具有已知高、中、无pre-ADA反应性的分子验证，且均在含药和不含药条件下进行检测，以排除非药物特异性反应。针对其他剂型或Fc段无PG突变的分子，企业2则采用桥接ADA检测范式或直接包被法作为替代方法。
企业3：针对含稳定效应功能缺失（SEFL）Fc突变的分子，采用人体通用间接检测法（Human Universal Indirect Assay, HUDA），即药物先与生物素偶联，血清中的pre-ADA在溶液中与生物素化药物结合后，再加入链霉亲和素包被板；随后利用包含两种不同单克隆抗体的通用检测混合物，检测总人IgG（所有IgG同种型）和IgM，实现标准化检测条件下不同候选药物的直接对比。该通用检测混合物包含一种钌标记的专利抗体，可结合所有人类野生型IgG Fc段，但不与含SEFL突变的人Fc段发生交叉反应；其余部分为市售的钌标记抗人IgM抗体。针对无Fc突变的分子，企业3采用桥接ADA检测格式。桥接检测虽被广泛用于ADA检测，但在存在多聚体药物靶点的情况下，易产生假阳性信号。将可溶性靶点引发的阳性信号误评估为ADA所致。
企业2和企业3均发现，其各自的检测方法检测到的pre-ADA反应性总体阳性率与桥接ADA检测法相近，但个体反应模式存在差异：企业3的方法无法检测IgA和IgD，企业2则无法检测IgM、IgA和IgD。在对人群组进行筛选时，IgM检测能力的缺失是可接受的，因为短暂的免疫反应会迅速转化为IgG反应，确保足够的抗体完成从IgM到IgG的类别转换。此外，企业2和企业3的灵敏度总体上均高于桥接ADA检测法，这一灵敏度优势源于其检测范式的特性：桥接ADA检测中，除了产生信号的ADA-试剂复合物外，还会形成一定比例的无信号复合物（如biotin/药物-ADA- biotin/药物）；而企业2和企业3基于Fc突变的检测方法中，ADA与单个药物的结合事件即可产生检测信号。由于两种检测方法在临床候选药物排名中得出的总体结论一致，因此被认定为pre-ADA筛选的合适主流平台。
三家企业均在筛选过程中保持检测条件一致，实现候选药物间的直接对比，保证评估结果的可靠性；同时监测缓冲液、阴性血清和通用阳性对照的信号，确保检测范式和条件的适用性。此外，研究人员还对关键检测试剂的质量要求进行了严谨评估和选择。
三家企业筛选的人血清样本数量相近，为40~54份，且主要来源于健康供体；尽管一般不使用疾病状态供体的血清样本，但对于复杂分子（如用于自身免疫性疾病治疗的药物），可选择性纳入此类样本。
Pre-ADA反应性的阳性率判定指标及风险分类阈值标准
三家企业均制定了特定标准，对pre-ADA反应性进行描述和对比，从而对候选分子进行排名。与临床免疫原性评估的分级方法相似，pre-ADA评估也采用1级（筛选）和2级（确证、竞争抑制）信号作为检测结果。
企业1：以54份个体血清样本的2级抑制率90百分位数作为阳性率判定指标。根据pre-ADA的显著性，54份血清样本可能表现出不同水平的pre-ADA反应性（以2级抑制率表示）。若受试药物的pre-ADA水平较低，54份样本的2级抑制率大多或全部处于低水平，因此90百分位数也较低（可低于30%）；若受试药物的pre-ADA水平较高，54份样本的2级抑制率大多或全部处于中高水平，因此90百分位数也较高（可高于55%）。该企业将2级抑制率90百分位数≥30%定义为中等风险，≥55%定义为高风险。
企业2：以检测组中10个最低个体检测值的99百分位数设定临界值，作为总体阳性率的评估依据。为验证药物特异性，研究人员还通过检测含药和不含药条件下的每份血清样本，计算差值以排除非药物特异性背景信号，其数据解读方式与其他检测范式采用的2级抑制法等效。该企业将检测组中pre-ADA阳性率>20%定义为中等风险，>50%定义为高风险。
企业3：通过检测确证试验中（与初始筛选检测信号相比），血清样本与过量未标记药物共孵育后的信号下降百分比，评估pre-ADA反应性/阳性率，该信号下降比例反映了检测信号中由药物特异性抗体产生的比例。企业3以确证试验中2级信号耗竭>40%的供体数量为评估依据，将>30%供体出现该现象定为桥接检测法的异常反应阈值，>40%供体出现该现象定为HUDA的异常反应阈值。这些标准会随着数据积累和实践经验丰富不断完善。
Pre-ADA阳性结果的表征
企业1：对于检测到高pre-ADA信号的多结构域分子，会通过竞争抑制法（与临床ADA检测的2级确证试验相似）开展结构域表征。
企业2：若最终选定的临床分子存在中、高pre-ADA风险，会根据项目具体需求和风险等级开展额外的pre-ADA评估，包括扩大供体检测组（纳入疾病状态样本）、尽早开发桥接ADA检测法、研究pre-ADA对药物活性的中和潜力等，必要时还需投入更多资源研究其对药物安全性的潜在影响；同时通常会开展结构域或表位表征，识别与分子设计相关的反应性结构域或表位。
企业3：对所有检测到高pre-ADA反应性的候选药物开展全面表征，一般会开展结构域表征以定位免疫原性结构域，在条件允许的情况下，还会进行表位表征以识别免疫原性表位。所有表征数据均会纳入数据库，为未来的分子设计提供参考。
最后
在药物开发早期开展pre-ADA筛选具有多重优势：可前瞻性识别潜在的免疫原性风险、对高反应性候选药物进行改造或剔除、建立内部数据库为未来的分子设计提供依据。Pre-ADA早期评估支持基于数据的候选药物选择，与行业强调的早期风险防控理念相一致。但该筛查也面临诸多挑战，如资源需求较高、临床意义存在不确定性、行业缺乏标准化操作流程等。因此，将pre-ADA筛选纳入临床前研究流程时，需平衡其优势与局限性。
尽管pre-ADA的存在并非必然产生临床后果或影响治疗结局，但在临床前开发阶段将pre-ADA研究纳入临床前免疫原性风险评估，能够为药物开发提供有价值的信息。基于本研究，提出以下操作建议：
1. 若资源允许，在先导化合物发现阶段，利用研发阶段样品对所有研发项目的早期分子开展pre-ADA评估。根据实践经验，研发阶段样品与临床/GMP阶段样品的检测结果无显著差异。为提高检测通量，可采用无需对受试物进行标记的通用标准化检测格式；并对最终候选分子，采用原型临床检测方法（如ACE-桥接法）进行复测。通常，通用检测格式与临床检测格式得出的pre-ADA阳性率总体具有良好的一致性。
2. 若资源有限，可优先评估高风险研发项目。无论何种情况，对早期分子的检测和最终分子的复测，能够帮助企业建立针对自身治疗领域和药物类型的内部数据库，进而明确风险阈值，提升pre-ADA检测结果的临床相关性。这一点至关重要，因为ADA检测信号和结果受检测范式、条件和临界值的影响极大。
3. 开展pre-ADA评估时，建议严格控制试剂质量，并在标准化pre-ADA研究中采用摩尔浓度的药物。例如，当使用标记试剂的检测方法将1级信号用于风险解读时，可通过质谱表征受试分子上的生物素或钌标记数量；或通过监测缓冲液、阴性血清和通用阳性对照的信号，确保检测范式和条件的适用性。
4. 血清样本的选择上，一般不使用疾病状态供体的血清样本，但可根据具体情况纳入（如用于自身免疫性疾病治疗的复杂结构分子）。此外，需对阳性对照（和阴性对照）材料及血清组进行表征，并持续使用，为检测范式的选择和检测条件的优化提供支持。例如，在先导化合物和候选药物阶段，抗独特型阳性对照通常难以获得，因此可将抗人Fc多聚体抗体或针对受试分子特有Fc突变的抗体，用作抗体类分子的通用阳性对照。
Pre-ADA评估已成为临床前免疫原性风险评估的重要组成部分，但目前行业尚无评估pre-ADA风险的标准化方法。本文总结了三家制药企业的pre-ADA筛选策略和方法学，尽管各企业采用的检测范式不同，且通过不同指标定义pre-ADA风险阈值，但在药物开发早期纳入pre-ADA评估，能够为分子选择提供重要参考。
引自：Early pre-existing anti-drug antibody screening in biotherapeutic development: a cross-company perspective
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