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Introduction
金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，可引起多种危及生命的感染，包括皮肤软组织感染、化脓性关节炎及败血症等。据统计，全球约85%的人口曾携带或感染过该细菌，多个国家中由金黄色葡萄球菌引起的难治性感染病例也呈上升趋势。过去数十年间，抗生素广泛应用于控制其感染，但由于过度使用，导致耐药菌株（如“超级细菌”）不断出现，已成为公共卫生领域的一大挑战。因此，开发安全、有效的抗生素替代品用于防治金黄色葡萄球菌感染，已成为当前研究的迫切需求。
乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）代谢产物胞外多糖（EPS）因其多种益生相关健康效应而受到广泛关注，包括免疫调节、抗氧化、抗病毒及潜在抗癌活性等。然而，其在抵御病原体感染方面的功能，特别是针对金黄色葡萄球菌的防护机制与实际效果，仍有待深入挖掘与阐明。内蒙古大学生命科学学院王潇教授团队，从瑞士乳杆菌WXD191中提取和分离得到一种新型多糖组分EPS，进行结构表征，并建立小鼠金黄色葡萄球菌感染模型，探讨了EPS对金黄色葡萄球菌USA300感染的保护作用。
Results and Discussion
益生菌多糖的理化性质、分子量和单糖组成分析
乳酸菌发酵液经过发酵、离心去除菌体、三氯乙酸除蛋白、过夜醇沉、透析及冻干得到粗多糖，粗多糖经过离子交换色谱和凝胶过滤色谱纯化得到实验多糖组分EPS。多糖EPS呈絮状粉末，易溶于水。通过高效液相色谱仪和离子色谱仪检测多糖EPS的分子量大小和单糖组成，分子量大小是84200 Da，EPS由阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、盐酸半乳糖胺、葡萄糖、盐酸氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸组成，比例为3:12.2:4.1:6.45:8.2:5.45:10.6。紫外和红外检测多糖不含核酸和蛋白质，具有典型多糖类特征吸收峰。
益生菌多糖的甲基化分析
为了确定EPS的糖苷键，进行多糖甲基化分析。甲基化分析结果表明，EPS的糖苷单元为Araf、Manp、Galp和Glcp。Manp残基主要以Manp-(1→（17.2%）、→2)-Manp-(1→（10.7%）、→2,6)-Manp-(1→（10.7%）形式存在，少量为→3)-Manp-(1→（4.0%）和→6)-Manp-(1→（3.3%）。上述信息表明甘露聚糖主链为(1→2)键合残基，而侧链主要在O-6位支链。在Araf方面，主要表现为(1→5)-连接残基（7.7%）和末端(t)-残基（10.4%）。此外，在(1→4)-（8.9%）、(1→3,6)-（4.5%）和t-linked（4.0%）。Galp中也发现了少量的Galp残基。同时，Glcp以(1→4)残基形式存在（14.7%）。因此，推测出EPS的主骨架可能由(1→2)-连接的Manp、(1→4)-连接的Galp、(1→5)-连接的Araf和(1→4)-连接的Glcp组成，这与单糖组成的实验结果一致。
益生菌多糖的核磁共振分析
通过一维NMR图谱（包括1H、13C和二维NMR图谱（1H-1HCOSY、HSQC、HMBC和NOESY））进一步确认EPS的结构。氢谱信号主要集中在δ 3.0～5.5之间。δ 3.2-4.0为糖环质子信号，主要端基质子峰δ 4.41、4.47、4.47、4.88、4.96、5.00、5.01、5.08、5.09、5.12、5.23、5.31的信号峰集中分布在δ 4.3~5.5区域内。碳谱分析在13C NMR（201 MHz, D2O）：核磁碳谱信号主要集中在δ 60～120之间。通过观察碳谱，可以看到主要异头碳信号峰δ 94.71、96.70、98.97、99.20、101.05、101.89、102.56、103.43、103.54、104.69、105.47、108.77、108.88异头碳区域主要在δ 93～105之间。
通过HSQC图谱，可以观察到异头碳信号为δ 105.47，HSQC图谱中对应的异头氢信号是δ 4.41，通过HH-COSY，H1-2的信号为4.41/3.29；H2-3的信号为3.29/3.51；H3-4的信号为3.51/3.65；可以推断出H1，H2，H3，H4分别为δ 4.41、3.29、3.51、3.65，而NOESY图谱观察到，δ 4.41与δ 3.61有相关峰，H5为δ 3.61。对应的C5为δ 77.69；C6的化学位移为δ 175.69。因此，该信号应归属于糖苷键→4)-β-D-GlcpA-(1→。通过HMBC图谱分析，→6-Man-1→的异头氢与自身的C6有相关峰，表明该多糖存在→6-Man-1→6-Man-1→。通过NOESY分析，存在糖苷键→3,6)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→、→3)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→、→4)-β-D-GlcpA-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→、→4)-β-D-GlcpA-(1→3-Man-1→、→3-Man-1→2-Man-1→、→2-Man-1→2-Man-1→、→2-Man-1→2,6-Man-1→、Man-1→6-Man-1→、→6-Man-1→2,6-Man-1→和→5)-α-L-Araf-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→。
结合单糖组成、甲基化分析，计算糖苷键的比例，结合核磁一维和二维的图谱分析，推断出EPS的主链结构为→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3-Man-1→2-Man-1→2,6-Man-1→2,6-Man-1→，支链链由α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→)和Manp-(1→6)-Manp-(1→)组成，因此，推测可能的结构式如图4所示。
小鼠体质量变化、存活率和血清趋化因子水平变化
在本研究中，建立小鼠金黄色葡萄球菌USA300感染模型，以评估EPS的体内保护效果。结果如图5所示，与PBS对照组相比，在感染前1 d及感染后1 d经EPS处理的小鼠体质量下降幅度显著减轻。同时，EPS处理组小鼠的存活率也显著高于PBS对照组。上述结果表明，EPS在小鼠体内对金黄色葡萄球菌USA300感染具有显著的保护作用。此外，实验评估了小鼠血清趋化因子的水平变化。与PBS组相比，EPS组产生较低水平的MCP-1，MIP-1α和MIP-1β。以上数据表明EPS限制了金黄色葡萄球菌感染期间趋化因子的产生。
细菌载菌量分析
本研究评估了金黄色葡萄球菌感染小鼠器官中的细菌载量。如图6所示，在感染后6 h，EPS组血液中的细菌数量明显减少。此外，心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏组织的金黄色葡萄球菌CFU计数也有所减少。上述结果表明EPS可抵御金黄色葡萄球菌定植。
组织病理学分析
实验观察感染金黄色葡萄球菌后小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的病理切片。结果如图7所示，PBS对照组的肝脏、脾脏、肺和肾脏可见多处细菌性脓肿。相比之下，EPS组在金黄色葡萄球菌感染后引起更轻的病变和更少的组织破坏。
Conclusion
本研究从L. helveticus WXD191中提取并纯化得到一种新的多糖（84.2 kDa）。结构特征分析表明EPS主链结构为→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3-Man-1→2-Man-1→2,6-Man-1→2,6-Man-1→，支链链由α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→)和Manp-(1→6)-Manp-(1→)组成。溶液构象结果显示，EPS呈α-螺旋构象。EPS处理小鼠后可以保护小鼠对金黄色葡萄球菌USA 300引起的感染。EPS处理小鼠体质量减轻小，并显著提高存活率，以及降低血清促炎趋化因子水平，快速清除小鼠脏器中金黄色葡萄球菌定植。综上所述，益生菌胞外多糖（EPS）展现出抑制金黄色葡萄球菌感染的潜力，是一种具有广阔应用前景的天然抗菌剂或免疫调节剂。鉴于其良好的生物相容性与可降解性，EPS在制药领域中具备作为辅助治疗剂和免疫调节剂的开发价值，尤其适用于应对耐药性金黄色葡萄球菌引起的感染问题，未来研究应进一步聚焦其构效关系及临床转化应用。
第一作者
盛守新，男，理学博士，主要研究方向为病原微生物感染机理、颗粒乳液递送等。参与国家自然科学基金等多项科研项目，目前在Journal of Nanobiotechnology、Plos Pathogens、International Journal of Biological Macromolecules、Vaccines等期刊发表高水平SCI论文10篇，其中第一作者5篇，授权国家发明专利1项。
通信作者
王潇，男，内蒙古大学生命科学学院教授，博士生导师。研究方向为病原微生物感染机理和宿主免疫应答机制，益生菌多糖功能挖掘等。现任中国遗传学会微生物遗传专业委员会委员、内蒙古免疫学会副理事长，内蒙古微生物学会常务理事。在Microbiome，Plos Pathogens等国际知名期刊累计发表研究论文50余篇，主编出版专著2部，承担国家和省部级重要科研项目15项。 入选内蒙古杰出青年，内蒙古 “草原英才”工程青年创新创业人才和内蒙古高等学校教坛新秀。
Probiotic-derived exopolysaccharide protects against Staphylococcus aureus bloodstream infection in mice
Shouxin Sheng#, Pu Wang#, Ying Xu, Yanchen Liang, Chunhe Li, Xuemei Bao, Haochi Zhang, Xiao Wang*
State Key Laboratory of Reproductive Regulation & Breeding of Grassland Livestock, School of Life Science, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China
# Both authors contributed equally.
*Corresponding author.
Abstract
Staphylococcus aureus infection is a global public health problem, searching and developing green alternatives for antibiotics are urgently required. In this study, the exopolysaccharides (EPS) produced by Lactobacillus helveticus WXD191 were extracted and purified. Structure analysis suggested that the EPS contained Ara, Man, Gal, GalN, Glc, GlcN, and GlcA, with a molecular of 84.2 kDa. Methylation combined with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy analysis revealed that the backbone of EPS was →3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3-Man-1→2-Man-1→2,6-Man-1→2,6-Man-1→. Congo red analysis and circular dichroism (CD) spectrum indicated the existence of α-helices. Crystalline characteristics, scanning electron microscopy, and thermogravimetric analysis revealed that EPS formed thermally stable amorphous with a small amount of microcrystalline structure and a rough and porous surface. Meanwhile, the S. aureus bloodstream infection model was used to evaluate the protection efficiency for systemic infection induced by S. aureus and found that the EPS could enhance survival as well as reduce bacterial burden and proinflammatory chemokines. Collectively, these results suggested that EPS isolated from L. helveticus was a competitive candidate for defense against S. aureus infection.
Reference:
SHENG S X, WANG P, XU Y, et al. Probiotic-derived exopolysaccharide protects against Staphylococcus aureus bloodstream infection in mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(8): 9250190. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250190.
本文编译内容由作者提供
编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇
封面图片：摄图网
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