Cell | 基于蛋白质降解的比率式转录激活系统|rta|丰度|激活系统|细胞|蛋白质|高通量

撰文 | 亦

蛋白质降解与稳态调控是维持细胞生命活动的核心机制，也是当前靶向蛋白质降解（如PROTAC和分子胶）药物研发的热点领域。然而，现有的蛋白质降解检测方法（如Western Blot、质谱定量以及外源融合荧光/发光标记等）普遍依赖于“信号缺失/信号降低”的检测模式【1-3】。这类模式存在几个瓶颈：1）信号无法放大：目标蛋白降解多少，信号就直接减少多少，缺乏二次放大机制；2）灵敏度受限：检测灵敏度严格受限于目标蛋白本身的表达丰度，对于低丰度蛋白或内源性微弱降解事件极难精准捕获；3）输出形式单一：无法灵活将降解信号转化为细胞生存、基因编辑或高通量测序等多样化的功能性生物学输出。

近日，来自美国斯坦福大学化学系的Steven M. Banik教授教授团队在Cell上发表了题为Ratiometric transcriptional activation by protein degradation的文章，打破了传统的“降解=信号减弱”思维定势，受天然 IκB/NF-κB 信号通路的启发，首次成功研发出一种名为比率式转录激活（Ratiometric Transcriptional Activation,RTA）的合成生物学电路。RTA 系统将目标蛋白（proteins of interest，POIs）的降解转化为下游可编程基因的“信号增强”转录输出。该系统的检测灵敏度由“POI-抑制剂”与“转录因子”的比率（Ratiometric）精确调控，实现了对内源低丰度蛋白降解的高灵敏度放大检测、多路复用以及高通量分子胶药物的筛选。

RTA 系统的设计原理与比率调控灵敏度机制

RTA 的基本设计是将POI与某种合成转录因子的蛋白质抑制剂（如针对SpyCas9 的Anti-CRISPR蛋白AcrIIA4）融合表达，同时在细胞内表达由sgRNA引导的转录激活因子（dCas9-VPR，即dCasA）。在基线状态下，POI-Acr 结合并抑制dCasA，下游转录处于关闭状态；当POI发生降解时，Acr随之降解，释放出游离的 dCasA，从而强力启动下游目标基因（如GFP）的转录，实现超过1,000倍的信号放大。

其核心创新点在于：电路的检测灵敏度（EC50）完全取决于 POI-Acr与dCasA 的相对分子比率（Acr/dCas ratio），而与目标蛋白降解本身的半数降解浓度（DC50）解耦。通过单克隆筛选调节Acr/dCas 比率，在目标蛋白降解效率DC50保持不变的前提下，下游GFP转录激活的灵敏度EC50可以在0.16 nM 到13 nM 之间进行跨越两个数量级的跨度调节。研究团队还开发了单转座子一体化载体（All-in-one construct），实现了低至200 pM 的超高检测灵敏度，并证实 RTA 具有对短时间暂态降解事件的“转录记忆”能力。

广谱降解机制兼容性与内源低丰度蛋白的精准检测

为验证RTA的通用性，研究人员在9种与癌症等疾病密切相关的靶蛋白（包括 SMARCA4、PBRM1、KRASG12C、BCL6、STAT3、SHP2、SHP1、PTPN1、EGFR 和 MYC）中构建了RTA线路。结果表明，无论目标蛋白定位于细胞核、细胞质还是细胞膜，也无论降解途径是泛素-蛋白酶体系统、小分子诱导聚合降解、蛋白类降解剂、溶酶体降解、siRNA 敲降 mRNA，甚至是稳定辅助因子缺失导致的靶蛋白失稳，RTA均能精准捕获并输出强烈的转录信号。

更为突出的是对内源性蛋白的检测能力。研究人员利用 PITCh 基因编辑技术在HEK293T细胞中对5种不同表达丰度的内源基因（ATM、PRMT9、RIOK3、MEK1、PARP1）进行了内源标记。在384孔板的高通量活细胞成像中，传统HiBiT或荧光蛋白直连标记在面对ATM等超低丰度内源蛋白降解时彻底失效，而RTA系统的Z' factor在所有内源靶点中均大于 0.5，展现出远超现有技术的超高信噪比与稳健性。

多路复用输出与高通量分子胶/降解剂筛选突破

RTA 具备极强的模块化扩展性。首先是单细胞多路复用，通过组合三种正交的 Cas/Anti-CRISPR 对，研究人员在单个细胞内构建了三重正交电路，实现了同时对三种不同靶蛋白降解事件的独立、无干扰三色荧光监测。其次是多样化功能输出与DNA条形码，下游输出基因可随意替换为促凋亡基因实现降解淘汰、抗生素抗性基因实现降解筛选，或是3'UTR RNA 条形码。结合转录组测序，实现混合细胞群体中大规模多靶点降解事件的高通量测序解码。最后是新降解剂与分子胶的前瞻性发现，利用MYC-RTA线路筛选7,347种临床小分子库，快速识别出他克莫司及其大环内酯类似物能够有效诱导MYC失稳降解。更重要的是，通过对920个Cereblon（CRBN）定向分子胶库进行高通量筛选，成功发现了针对全新靶点UBE2S的CRBN依赖性分子胶降解剂（HRZ-01-089-1 和 HRZ-01-182-1），并在K562和 Jurkat细胞中验证了对内源UBE2S的特异性降解。

综上，该研究成功建立了比率式转录激活（RTA）技术平台，巧妙地利用 Anti-CRISPR 与 CRISPRa 系统之间的化学计量学比率关系，将难以直接观察的“目标蛋白降解/减少”物理事件，转化为可高度放大、可编程且正交的“转录激活/基因表达”信号。为合成生物学基因电路设计提供了全新的定量调控范式，也有望极大加速针对“无药可靶向”蛋白的降解药物开发进程。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2026.08.009

制版人：十一

参考文献

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（*排名不分先后）